韩国漂亮老师做爰bd_欧洲欧美成人免费大片_美女的屁股视频网站_徐若瑄三级真做

ALKBH5通過m6A-YTHDF2依賴性方式影響骨肉瘤的發展

欄目:最新研究動態 發布時間:2022-08-09
從機制上講,ALKBH5通過m6A-YTHDF2依賴性方式增加SOCS3表達,從而使STAT3途徑失活。本文于......


m6A是最常見和最豐富的mRNA修飾,在許多生物過程中起著至關重要的作用。然而,作為一種關鍵的RNA去甲基酶,ALKBH5在人類骨肉瘤中的研究尚不充分。本研究旨在探討ALKBH5介導的m6A修飾及其在骨肉瘤中的潛在機制。我們的數據表明,ALKBH5的低表達與骨肉瘤患者的總體生存率較差相關。通過ALKBH5上調降低人骨肉瘤細胞中m6A mRNA水平導致細胞增殖抑制、細胞凋亡和周期阻滯。我們發現STAT3的負調控因子SOCS3ALKBH5介導的m6A修飾的下游靶點。而m6A修飾的SOCS3 mRNAYTHDF2識別,促進SOCS3的衰變。從機制上講,ALKBH5通過m6A-YTHDF2依賴性方式增加SOCS3表達,從而使STAT3途徑失活。本文于2022年發表在 “eBioMedicine”IF=11.205)上。


技術路線


image.png


結果

1ALKBH5在骨肉瘤中的表達及其與患者生存的關系

我們的數據驗證了ALKBH5與人類OS(骨肉瘤)總生存率之間的負相關。根據ALKBH5 mRNA相對表達的中位數,OS組分為高表達組和低表達組。所有患者術前均未接受抗腫瘤治療。如圖1a所示,與低ALKBH5組相比,高ALKBH5腫瘤組織的m6A總甲基化水平較低。通過免疫組織化學染色進一步評估ALKBH5的表達水平。圖1b顯示了ALKBH5染色的代表性高表達或低表達圖像。我們研究了ALKBH5表達與骨肉瘤患者預后之間的相關性。Kaplan-Meier生存分析表明,低ALKBH5表達患者的總生存時間明顯短于高ALKBH5表達患者(圖1c)。此外,對取自正常骨和骨肉瘤組織的15個樣本進行了western bolt分析。在兩種組織中均檢測到ALKBH5的表達,但與正常骨相比,骨肉瘤中的表達顯著降低(圖1d)。


image.png


2ALKBH5介導的m6A甲基化減少抑制骨肉瘤細胞生長并促進細胞凋亡

為了探索ALKBH5介導的U2OSKHOS細胞系中m6A甲基化的影響,我們使用慢病毒轉染上調ALKBH5,并且通過western blot證實ALKBH5過表達(圖2a)。ALKBH5上調細胞表現出m6A mRNA甲基化減少(圖2b)。在功能上,ALKBH5的過表達抑制細胞增殖,誘導細胞周期阻滯并促進細胞凋亡。通過CKK-8測定觀察到細胞活力降低(圖2c)。流式細胞術在這兩種細胞系中觀察到大量凋亡(圖2d)。進行TUNEL染色以確認誘導細胞凋亡(圖2e)。我們的細胞周期分析表明,骨肉瘤細胞大多在G0/G1期停滯,這意味著在過表達ALKBH5后分裂的腫瘤細胞數量減少(圖2f)。為了更好地了解ALKBH5在骨肉瘤中的作用,我們還對KHOS細胞系進行了敲除實驗。使用SiRNA下調ALKBH5,并通過western blot證實ALKBH5下調(圖2g)。進行流式細胞術(圖2h)和TUNEL(圖2i)分析,確認由ALKBH5下調引起的細胞凋亡減少。細胞周期分析(圖2j)表明,在敲除ALKBH5后,分裂的腫瘤細胞數量增加。


image.png


3RNA測序鑒定骨肉瘤甲基化改變的轉錄本

我們對ALKBH5過表達的KHOS細胞進行了RNA測序,結果表明,相對于conrtols,轉錄物的表達發生了改變(圖3a)。基因集富集分析表明,差異表達基因與細胞增殖、細胞周期和凋亡密切相關。我們還發現,骨肉瘤細胞系中m6A甲基化的降低顯著改變了STAT3信號通路(圖3bc)。我們接下來通過研究STAT3的磷酸化狀態來確定骨肉瘤細胞中m6A甲基化的減少是否影響STAT3信號。與對照細胞系相比,ALKBH5過表達細胞系顯示STAT3的磷酸化水平降低(圖3d)。為了弄清楚STAT3磷酸化的這些變化是否刺激STAT3信號傳導,我們評估了STAT3下游靶點的表達水平。與對照組相比,CyclinD1c-Mycbcl-2在細胞中的活性降低。這些結果表明,減少m6A甲基化可使STAT3途徑失活。


image.png



4m6A甲基化調節STAT3激活調節因子的表達

ALKBH5過表達后,STAT3 m6A修飾沒有明顯影響(圖4a),這表明STAT3可能不是骨肉瘤中ALKBH5的直接靶點。為了確定STAT3調控m6A甲基化的潛在機制,我們檢測了STAT3的負調節因子SOCS3。我們在U2OSKHOS細胞中過表達ALKBH5。在ALKBH5過表達后,SOCS3 m6A修飾減少(圖4b)。通過分析已發布的m6A序列數據集(GSE37005),我們發現SOCS3 mRNA 3’ UTR具有高度富集和特異的m6A峰,并在RMBase v2.0中識別出SOCS3-3’UTR的四個m6A位點。我們在SOCS3中的四個假定m6A位點(AT)進行突變,表示為SOCS3MUTSOCS3-MUT1SOCS3-MUT2SOCS3-MUT3SOCS3-MUT4(僅包含一個潛在m6A位點)和SOCS3-MUT1-4(包含所有四個潛在m6A位點)(圖4c)。然后,我們使用MeRIP-qPCR檢測了SOCS3-WTSOCS3 MUT中的m6A修飾水平。與ALKBH5的對照載體相比,ALKBH5減少了骨肉瘤細胞中SOCS3-WTSOCS3-MUT1SOCS3-MUT2SOCS3-MUT3SOCS3-MUT4m6A修飾。然而,由于m6A位點突變的存在,與SOCS3-WT相比,SOCS3 MUT(僅包含一個潛在m6A位點)中m6A修飾的減少程度受到抑制。在ALKBH5過表達的U2OSKHOS細胞中,SOCS3-MUT1-4m6A修飾(包含所有四個潛在的m6A位點突變)沒有減少(圖4d)。基于RT-qPCR,當ALKBH5U2OSKHOS細胞中過表達時,SOCS3表達升高(圖4e)。此外,我們發現,當用3-脫氮腺苷(DAA)處理時,骨肉瘤細胞的SOCS3 m6A修飾水平降低(圖4f)。同時,SOCS3表達顯著增強(圖4g)。但在SOCS3-MUT1-4中未檢測到DAA引起的m6A修飾減少(圖4h)。我們還檢測到骨肉瘤組織中m6A甲基化和SOCS3表達之間存在線性相關性(圖4i)。DAA是一種非選擇性藥物,可以全局改變轉錄物的甲基化。該甲基化抑制劑用于驗證ALKBH5介導的m6ASOCS3 mRNA穩定性的影響。


image.png


5ALKBH5的過表達通過m6A-YTHDF2依賴機制增強SOCS3 mRNA的穩定性

我們推測SOCS3轉錄物是YTHDF2的靶點。為了檢測YTHDF2是否直接結合SOCS3 mRNAm6A修飾位點,進行了雙熒光素酶報告實驗。如圖5a所示,敲低YTHDF2增加了攜帶SOCS3野生型3’ UTR片段的報告者的熒光素酶活性,而當m6A位點發生突變時,這些變化被消除。在骨肉瘤的生物信息學分析中,觀察到YTHDF2和SOCS3之間呈負相關(圖5b)。與上述假設一致,在骨肉瘤細胞中抑制YTHDF2可提高SOCS3的表達,其程度與ALKBH5的過表達相似(圖5c)。通過western blot證實了YTHDF2敲除效率(圖5c)。我們還敲除了三個YTHDF同源序列(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3),以確定三個YTHDF蛋白是否共同作用以增強m6A修飾的SOCS3的降解。有趣的是,三次敲除后,SOCS3表達顯著增加。然而,與單獨下調YTHDF2相比,當這三者同時下調時,可以看到少量增加。在本研究中,與單獨敲除YTHDF2相比,三重敲除并沒有顯示出顯著更大的效果。接下來,我們進行RNA下拉分析以證明YTHDF2結合骨肉瘤細胞中的SOCS3全長轉錄物(圖5d)。此外,我們檢測了ALKBH5過表達或YTHDF2抑制的骨肉瘤細胞和對照細胞中的RNA衰減率。骨肉瘤細胞中ALKBH5過表達和YTHDF2抑制后,SOCS3 mRNA半衰期顯著增加(圖5e)。為了證實YTHDF2參與ALKBH5對SOCS3的調節,我們在YTHDF2缺失的細胞中調節了ALKBH5的表達,并檢測了SOCS3 RNA的衰減率(圖5f)。我們進一步探討了ALKBH5、YTHDF2和SOCS3之間的臨床相關性。結果表明,SOCS3表達與ALKBH5呈正相關。然而,在人骨肉瘤組織中,YTHDF2表達與SOCS3呈負相關(圖5g,h)。我們的研究表明,ALKBH5的過表達通過m6A-YTHDF2依賴機制增強SOCS3 mRNA的穩定性。


image.png 


6STAT3信號的抑制介導m6A甲基化降低對骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響

為了確定STAT3失活是否是骨肉瘤細胞m6A甲基化降低后觀察到的增殖抑制、凋亡增加和周期停滯的基礎,我們試圖通過敲除SOCS3來挽救這些表型。SOCS3的下調增加了ALKBH5過表達細胞中p-STAT3的表達(圖6ab)。在功能上,SOCS3敲除挽救了由ALKBH5上調引起的增殖抑制(圖6c)、凋亡升高(圖6de)和周期阻滯促進(圖6f)。


image.png


7)過表達ALKBH5抑制人體骨肉瘤生長

為了進一步研究ALKBH5在人骨肉瘤中的功能,我們在裸鼠皮下移植實驗中檢測ALKBH5是否對骨肉瘤的致瘤性產生關鍵影響。與對照組相比,當植入穩定表達ALKBH5U2OS細胞時,腫瘤的生長被有效抑制(圖7ab)。通過IHC染色對腫瘤樣本進行分析,結果表明,在ALKBH5過表達組中,SOCS3的染色增加,STAT3的表達減少(圖7c)。此外,在YTHDF2下調組中,腫瘤生長被有效抑制。然而,ALKBH5YTHDF2缺乏組的腫瘤生長沒有顯著影響(圖7d)。總的來說,ALKBH5在人骨肉瘤中通過m6A-YTHDF2依賴性方式發揮腫瘤抑制作用。


image.png


結論:我們的研究結果闡明了ALKBH5介導的m6A修飾在人類骨肉瘤中的臨床意義以及腫瘤增殖和生長的調節機制,表明ALKBH5是治療人類骨肉瘤的潛在生物標記物。


參考文獻:Yang Z, Cai Z, Yang C, Luo Z, Bao X. ALKBH5 regulates STAT3 activity to affect the proliferation and tumorigenicity of osteosarcoma via an m6A-YTHDF2-dependent manner. EBioMedicine. 2022 Jun;80:104019. doi: 10.1016/j.ebiom.2022.104019. Epub 2022 Apr 28. PMID: 35490460; PMCID: PMC9062761.