肺癌是最常見的癌癥類型，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的85%。目前近年來在肺癌的診斷和治療方法上取得了很大的進(jìn)步，但NSCLC患者的5年總體生存率仍不令人滿意。tRNA衍生片段(tRFs)是一種新型的小非編碼RNA，由成熟或前體轉(zhuǎn)移RNA (tRNAs)的特異性切割產(chǎn)生。在某些癌細(xì)胞中，一些tRFs與增殖、遷移和侵襲有關(guān)。然而，tRFs是否以及如何參與NSCLC的腫瘤發(fā)生仍然是一個很大的未知數(shù)。該研究發(fā)表于《Journal of Hematology & Oncology》，IF:14.136。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. Circulating tRFs在NSCLC患者術(shù)前和術(shù)后血漿樣本中存在差異表達(dá)

為了識別和表征在NSCLC中差異表達(dá)的Circulating tRFs，作者比較了9對來自NSCLC患者術(shù)前和術(shù)后血漿樣本的tRF表達(dá)譜。tRF和tiRNA測序顯示tRF表達(dá)譜在術(shù)前和術(shù)后血漿樣本之間存在顯著差異(圖1A)。Circulating tRFs的長度在15 - 50個核苷酸(nt)之間，分別有53.97%和30.11%的tRFs在20 – 23 nt和31 – 33 nt之間(圖1B)。值得注意的是，大部分術(shù)后血漿中tRFs的表達(dá)水平明顯低于術(shù)前血漿樣本(圖1B)，提示血漿中tRFs上調(diào)與NSCLC中腫瘤的存在相關(guān)。另外，不同的tRNAs通過切割成具有相同序列的片段可以產(chǎn)生一種類型的tRF或tiRNA(圖1C, D)。大多數(shù)血漿tRF來自tRNAs的5’端，同樣，tiRNA系列更多屬于tiRNA-5 (Fig. 1E, F)。

圖1非小細(xì)胞肺癌患者血漿tRF譜特征

2. tRF AS-tDR-007333在NSCLC中表達(dá)上調(diào)

與術(shù)后血漿樣品相比，手術(shù)前血漿樣品中確定了4個上調(diào)TRF和4個下調(diào)tRF。通過qRT-PCR檢測，證實(shí)AS-tDR-007333在NSCLC患者術(shù)前血漿中表達(dá)水平明顯高于術(shù)后血漿標(biāo)本 (圖2A)。另外，NSCLC患者(n=29)和健康對照(n=45)血漿樣品組的qRT-PCR分析顯示，NSCLC患者血漿AS-tDR-007333濃度顯著高于健康對照(圖2B)。受試者工作特征(ROC)分析顯示曲線下面積(AUC)為0.9379(敏感性=97.78%，特異性=79.31%)(圖2C)，提示血漿AS-tDR-007333的水平具有作為診斷NSCLC生物標(biāo)志物的潛力。此外，AS-tDR-007333在NSCLC細(xì)胞株(PC9、HCC827、NCI-226和A549)中的表達(dá)水平也高于正常人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)(圖2D)。此外，AS-tDR-007333在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于相鄰正常組織 (圖2E)。綜上所述，多項(xiàng)證據(jù)明確表明AS-tDR-007333在NSCLC中表達(dá)上調(diào)，并可能在NSCLC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖2 tRF AS-tDR-007333在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后較差相關(guān)

3. AS-tDR-007333的高表達(dá)與NSCLC預(yù)后不良相關(guān)

為了評估AS-tDR-007333在NSCLC患者中的臨床意義，用FISH法測定了AS-tDR-007333在NSCLC腫瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示AS-tDR-007333水平與TNM分期呈正相關(guān)(圖2F, H)，提示AS-tDR-007333水平與NSCLC的進(jìn)展相關(guān)。此外，AS-tDR-007333在細(xì)胞質(zhì)中比在細(xì)胞核中更豐富(圖2G)。根據(jù)AS-tDR-007333的細(xì)胞質(zhì)評分分為兩組(評分≥3，高表達(dá);分?jǐn)?shù)≤3，低表達(dá))，Kaplan Meier生存分析顯示，高AS-tDR-007333水平與NSCLC患者較低的總生存相關(guān)(圖2I)。因此，臨床資料強(qiáng)烈表明，高AS-tDR-007333水平與NSCLC患者不良預(yù)后相關(guān)。

4. AS-tDR-007333促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移

為了評估AS-tDR-007333在NSCLC中的生物學(xué)功能，在NSCLC細(xì)胞中進(jìn)行了過表達(dá)和敲除實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)AS-tDR-007333顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，而敲低AStDR-007333顯著抑制NSCLC細(xì)胞增殖(圖3A-D)。為了驗(yàn)證AS-tDR-007333對NSCLC細(xì)胞增殖的影響是否反映細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期進(jìn)程。結(jié)果表明，過表達(dá)AS-tDR-007333可將PC9細(xì)胞阻滯在S期，而抑制AS-tDR-007333可降低S期細(xì)胞的比例(圖3E-H)，A549細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果(圖3I-L)。此外，過表達(dá)AS-tDR-007333組的遷移細(xì)胞數(shù)量明顯高于對照組，而AStDR-007333抑制劑逆轉(zhuǎn)了這些影響(圖3M-Q)。

圖3 AS-tDR-007333促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移能力

5. AS-tDR-007333通過上調(diào)MED29增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞增殖

為了探究AS-tDR-007333調(diào)控的靶基因，將AS-tDR-007333轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中。RNA-seq分析顯示，AS-tDR-007333過表達(dá)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜與NC細(xì)胞不同(圖4A, B)。在差異表達(dá)基因中，AS-tDR-007333過表達(dá)上調(diào)最高的是MED29(圖4C)。GO分析顯示，差異表達(dá)基因在細(xì)胞組分的中介復(fù)合物(medium complex, MED)中顯著富集(圖4D)。此外，MED29在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(圖4E)。同樣，qRT-PCR和Western blot分析證實(shí)，MED29基因和蛋白在NSCLC細(xì)胞中顯著上調(diào)(圖4F)。綜上所述，這些結(jié)果提示AS-tDR-007333誘導(dǎo)的MED29上調(diào)可能在NSCLC的發(fā)病中起重要作用。

為了驗(yàn)證AS-tDR-007333與MED29在NSCLC中的關(guān)系，將AS-tDR-007333轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中。Western blot和qRT-PCR分析顯示，過表達(dá)AS-tDR-007333顯著促進(jìn)了MED29的表達(dá)，而抑制AS-tDR-007333則降低了MED29的表達(dá)水平(圖4G)。此外，CCK-8檢測顯示，上調(diào)MED29促進(jìn)A549和PC9細(xì)胞的增殖(圖4H, I)，而下調(diào)MED29抑制NSCLC細(xì)胞的生長速度(圖4J, K)。綜上所述，這些結(jié)果提示AS-tDR-007333促進(jìn)了MED29的表達(dá)，而MED29隨后作為癌基因增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞的增殖。

圖4 AS-tDR-007333通過上調(diào)MED29促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖

6. AS-tDR-007333與HSPB1相互作用，表觀遺傳學(xué)增強(qiáng)MED29的轉(zhuǎn)錄

為了闡明AS-tDR-007333在NSCLC中發(fā)揮生物學(xué)功能的機(jī)制，進(jìn)行了RNA-pulldown實(shí)驗(yàn)，然后在NSCLC細(xì)胞中進(jìn)行了質(zhì)譜分析(圖5A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AS-tDR-007333與幾種與癌癥相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白發(fā)生沉淀，包括HSPB1、DHX9、ACTB、YBX3和ILF2 (圖5B)。其中，鑒于作者比較感興趣的是HSPB1，因?yàn)?/span>HSPB1匹配分最高，并且有報道稱HSPB1與NSCLC的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)AS-tDR-007333特異性結(jié)合內(nèi)源性HSPB1(圖5C)。計算蛋白質(zhì)RNA對接分析也表明，HSPB1蛋白中的幾個氨基酸殘基對AS-tDR-007333結(jié)合至關(guān)重要(圖5D)。這些數(shù)據(jù)提示AS-tDR-007333可能通過直接結(jié)合HSPB1在NSCLC細(xì)胞中發(fā)揮其生物學(xué)功能。

確定AS-tDR-007333是否通過與HSPB1相互作用調(diào)控NSCLC細(xì)胞增殖。首先檢測了HSPB1在NSCLC細(xì)胞系和BEAS-2B細(xì)胞中的表達(dá)水平。qRT-PCR和Western blot結(jié)果一致顯示，HSPB1在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于BEAS-2B細(xì)胞(圖5E,F)。si-HSPB1和AS-tDR-007333共轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞的挽救實(shí)驗(yàn)顯示，si-HSPB1可顯著降低過表達(dá)AS-tDR-007333增加的細(xì)胞增殖能力(圖5G-J)，這表明AS-tDR-007333對NSCLC細(xì)胞增殖的影響是功能依賴的，至少部分依賴于HSPB1。

圖5 AS-tDR-007333在NSCLC細(xì)胞中直接與HSPB1結(jié)合并相互作用

AS-tDR-007333可以與HSPB1互作，增強(qiáng)MED29的表達(dá)，因此推測AS-tDR-007333可能通過調(diào)控HSPB1來發(fā)揮其生物學(xué)功能，從而進(jìn)一步修飾MED29的表達(dá)和功能。為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，將AS-tDR-007333及其抑制劑轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AS-tDR-007333增加了HSPB1基因和蛋白的表達(dá)水平，而敲除AS-tDR-007333降低了HSPB1的表達(dá)(圖6A-D)。敲除HSPB1不僅抑制了HSPB1的表達(dá)，還抑制了MED29的表達(dá)(圖6E, G)。Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，在NSCLC細(xì)胞中，HSPB1可以與MED29結(jié)合(圖6F)，表明HSPB1和MED29之間存在潛在的相互作用。熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，AS-tDR-007333上調(diào)可顯著提高MED29啟動子活性，而AS-tDR-007333與si-HSPB1共轉(zhuǎn)染可降低MED29啟動子活性(圖6H)。在功能上，將MED29和si-HSPB1共轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中可以顯著抑制MED29對細(xì)胞增殖的影響(圖6I, J)。綜上所述，AS-tDR-007333可能通過激活HSPB1-MED29的相互作用來增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的增殖。

組蛋白修飾在基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳調(diào)控中起著重要作用。Western blot檢測結(jié)果顯示，與野生型細(xì)胞相比，si-HSPB1抑制H3K4me1和H3K27ac的表達(dá)水平(圖6K)。此外，ChIP-qPCR檢測表明，HSPB1敲除顯著降低了MED29啟動子區(qū)H3K4me1和H3K27ac的水平(圖6L, M)。因此，這些數(shù)據(jù)表明AS-tDR-007333可能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，至少部分是通過HSPB1介導(dǎo)的MED29啟動子中的H3K4me1和H3K27ac修飾實(shí)現(xiàn)的。

圖6 AS-tDR-007333激活HSPB1調(diào)控MED29啟動子區(qū)H3K4me1和H3K27ac水平

7. AS-tDR-007333通過激活ELK4介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控上調(diào)MED29

由于HSPB1-MED29相互作用只能部分解釋MED29的表達(dá)，并且已經(jīng)有人提出轉(zhuǎn)錄因子(TF)可以靶向特定的MED亞基誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，因此推斷MED29的轉(zhuǎn)錄可能受到特定轉(zhuǎn)錄因子的影響。利用JASPAR和UCSC數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)MED29啟動子包含轉(zhuǎn)錄因子ELK4假定的結(jié)合位點(diǎn)(圖7A)。為了評估ELK4對NSCLC的影響，將si-ELK4轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)si-ELK4顯著抑制了NSCLC的增殖(圖7B，C)。將AS-tDR-007333轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)AStDR-007333過表達(dá)顯著促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞中ELK4的表達(dá)水平(圖7D, E);相反，抑制AS-tDR-007333顯著降低了ELK4的表達(dá)(圖7D, F)。挽救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)AS-tDR-007333在NSCLC細(xì)胞增殖中與si-ELK4相互作用(圖7G，H)。 ChIP-PCR和熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)ELK4直接結(jié)合到MED29基因的預(yù)測啟動子區(qū)域(圖7I, J)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明AS-tDR-007333與ELK4相互作用修飾MED29啟動子轉(zhuǎn)錄。

圖7 AS-tDR-00733通過ELK4介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控MED29

8. 靶向AS-tDR-007333在體內(nèi)抑制NSCLC細(xì)胞生長

鑒于AS-tDR-007333在NSCLC中扮演著致癌腫瘤因子的角色，推測抑制AS-tDR-007333可能對NSCLC有治療作用。為了評價AS-tDR-007333抑制劑的體內(nèi)治療效果(圖8A)，合成AS-tDR-007333靶向抑制劑，并對其進(jìn)行了優(yōu)化，用于體內(nèi)研究。如圖8B、C所示，在整個實(shí)驗(yàn)期間，AS-tDR-007333抑制劑組的腫瘤體積明顯小于NC組或空白對照組。AS-tDR-007333抑制劑組平均腫瘤重量顯著高于對照組；與NC和對照組相比，AS-tDR-007333抑制劑組移植瘤組織中AS-tDR-007333、HSPB1、ELK4和MED29的表達(dá)水平顯著降低(圖8F-I)， AS-tDR-007333抑制劑同時抑制了移植瘤組織中MED29和Ki-67蛋白的表達(dá)水平(圖8J)。因此，這些結(jié)果提示AS-tDR-007333抑制劑在體內(nèi)可以通過抑制MED29的表達(dá)來抑制NSCLC腫瘤生長。

圖8靶向AS-tDR-007333 inhibitor抑制了體內(nèi)NSCLC腫瘤生長

結(jié)論：

該研究確定AS-tDR-007333為NSCLC中的一種新型致癌腫瘤因子。AS-tDR-007333通過激活HSPB1和ELK4介導(dǎo)的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控軸，靶向致癌MED29，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的惡性腫瘤。此外，AS-tDR-007333抑制體外和體內(nèi)NSCLC細(xì)胞增殖。該數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了tRF在NSCLC中的重要性，并表明AS-tDR-007333可以作為一種有前途的診斷/預(yù)后生物標(biāo)志物和新的NSCLC治療靶點(diǎn)(圖9)。

圖9 AS-tDR-007333如何通過HSPB1-MED29和ELK4-MED29軸促進(jìn)NSCLC的發(fā)生

參考文獻(xiàn)：

Yang W, Gao K, Qian Y, Huang Y, Xiang Q, Chen C, Chen Q, Wang Y, Fang F, He Q, Chen S, Xiong J, Chen Y, Xie N, Zheng D, Zhai R. A novel tRNA-derived fragment AS-tDR-007333 promotes the malignancy of NSCLC via the HSPB1/MED29 and ELK4/MED29 axes. J Hematol Oncol. 2022;15(1):53.