血管性癡呆（VaD）是全球第二大常見的癡呆病因。與生活習慣相關的風險因素對VaD的貢獻越來越大，這表明基因-環境的相互作用。因而本研究旨在探究慢性腦灌注不足(CCH)的VaD小鼠模型中的DNA甲基化景觀。作為基因-環境相互作用之間的聯系，間歇性禁食（IF）作為一種預防性干預被引入。本研究幫助我們了解IF如何保護大腦不受CCH損傷并有望為減輕VaD的神經病理和認知缺陷提供潛在的有益作用。本文于2022年3月發表在《Theranostics》IF：11.556期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、在生理條件下IF誘導代謝轉換提高工作記憶并調節DNA甲基化景觀

為驗證IF實施的有效性，首先定期檢測了小鼠的體重，血糖和酮水平，結果顯示，和隨意飲食（AL）喂養小鼠比較，IF小鼠的體重/攝食量、血糖水平均顯著下降，酮水平顯著升高。表明IF小鼠發生代謝轉換。

附圖1在CCH生理條件下IF對小鼠的影響

為了探究在正常生理調節下IF是否可以改善認知功能和調節DNA甲基化景觀，對AL野生小鼠（ALWT）和IF野生小鼠（IFWT）進行行為學測試和RRBS實驗。結果顯示，和ALWT比較，IFWT組的的學習能力更強（圖1A-1C），并且這種能力改變不是由于運動能力受損（圖1D）。

DNA甲基化包括三種：CG，CHG，CHH。如圖1E展示了ALWT和IFWT小鼠在CG和非CG水平的差異甲基化基因（DMGs），IFWT小鼠的甲基化狀態偏向低甲基化狀態。與ALWT小鼠相比，IFWT小鼠的差異甲基化區域(DMRs)總體甲基化水平較低（圖1F-K）。為探究DNA甲基轉移酶（DNMT）和脫甲基酶，作者檢測了DNMT1，DNMT3A，DNMT3B和TET1的豐度，與AL鼠比較，前三者的豐度在IF小鼠中上調，后者則顯著下調（圖1L）。表明DNMTs和TET1在生理狀態下調節DMGs的表達。

圖1間歇性禁食改善認知功能和調節生理條件下的DNA甲基化景觀

2、IF可減輕CCH患者的認知功能障礙和神經病理改變

為探究IF在VaD的CCH模型中的作用，評估了認知功能和神經病理（圖2A）。與AL sham組比較，AL喂養鼠構建的CCH（AL BCAS）小鼠表現出更差的學習能力和更長的潛伏期，而IF BCAS鼠則學習能力更強，潛伏期更短，且這種潛伏期改變不是由于運動能力受損（圖2B）。這些表明IF可改善認知功能。

圖2C-D表明在所有不同的時間點，AL BCAS小鼠的白質病變均顯著高于AL Sham組小鼠，而白質損傷在IF BCAS小鼠中則顯著減少。CCH 誘導的神經元丟失在 AL BCAS 小鼠的海馬 CA1、CA2 和 CA3 區域中很明顯，而AL Sham顯示正常的神經元細胞體，在所有三個海馬區都有不同的細胞核、核仁和密集的神經元，而IF BCAS 小鼠的神經元損失較少（圖2E-F）。表明IF改善神經病理損傷。

圖2間接性禁食可減輕慢性腦灌注不足患者的認知功能障礙和神經病理改變

3、CCH條件下的DNA甲基化景觀改變被預防性IF校正

為了研究CCH下的DNA甲基化情況，進行了RRBS實驗，并對數據進行了分析（圖3）。根據DMGs繪制的熱圖，AL BCAS小鼠的整體DNA甲基化模式與相應的sham有明顯的偏差（圖3A）。這種與對照組差異甲基化的偏差在AL BCAS小鼠的所有三個時間點都一致觀察到。如果使用IF，BCAS小鼠與AL BCAS小鼠的甲基化圖譜出現偏差（圖3B）。圓環圖顯示，在AL BCAS小鼠的三個不同時間點上，基因低甲基化趨勢一致增加（圖3C）。除了這些視覺證據外，AL BCAS小鼠在7、15和30天時間點分別特有427、379和377個差異甲基化基因（圖4A）。此外，41個基因在三個不同的時間點上的差異甲基化共享。這些結果表明在CCH狀態下，總體DNA甲基化景觀發生了改變。

與喂食 AL 的小鼠相比，在接受 CCH 的 IF 小鼠的三個時間點上觀察到的低甲基化趨勢一致下降（圖3D），表明甲基化趨勢發生逆轉。有538、318和328個DMGs分別為IF BCAS小鼠7、15和30天時間點所獨有（圖4B）。45 個基因在三個不同的時間點均發生差異甲基化。因此，在CCH條件下被改變的DNA甲基化格局在引入預防性IF后被進一步校正。

此外，為了確定DNA甲基轉移酶和去甲基化酶是否在CCH病理狀態下調節基因差異甲基化中發揮作用，研究了DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和TET1的豐度。與AL BCAS小鼠相比，在30天時間點，IF BCAS小鼠的所有三種DNMTs和TET1均顯示有統計學意義的增加（圖3E）。這一發現強調了DNMTs和TET1通過引入IF在CCH調控DMGs表達中發揮作用。

圖3 間歇性禁食調節慢性腦灌注不足下DNA甲基化的異常變化

4、預防性IF提示CCH狀態下啟動子區DNA甲基化狀態發生逆轉

作者分別分析了高甲基化hyper-和低甲基化hypo-基因，以縮小它們在CCH下的潛在功能。AL條件下共有929個基因發生高甲基化，771個基因發生低甲基化（圖4A）。ACTN1和GNAS的基因表達用于驗證甲基化狀態（圖4C）。此外，在IF條件下有599個基因高甲基化，1113個基因低甲基化（圖4B）。值得注意的是，根據文獻證據，這些基因大多數與癡呆癥或其他神經退行性疾病有關。且MRP4的基因表達已被驗證為甲基化狀態（圖4C）。

為了研究IF對DNA甲基化的影響，分析了CCH病理狀態下和預防性IF下的差異甲基化基因(DMGs)。CCH狀態共檢測到355個DMGs，其中7、15和30天時間點分別有107、104和104個DMGs是唯一的，3個不同時間點有5個DMGs重疊（圖4D）。與飼喂AL的CCH小鼠相比，飼喂預防性IF的小鼠共檢測到348種DMGs。在這些DMGs中，分別有121、86和97個DMGs在7、15和30天時間點是唯一的，4個DMGs在三個時間點重疊（圖4E）。對重疊的DMGs進一步分析其甲基化狀態，以觀察是否存在時間調控（圖4F）。基因甲基化水平的時間調控對每個基因都是獨特的，在某些情況下(如DDX3Y, GNAS, PAX6, ZRSR1)，這種變化足以從高甲基化狀態切換到低甲基化狀態或反之亦然。

圖4 間歇性禁食提示慢性腦灌注不足下啟動子區DNA甲基化狀態發生逆轉

參考文獻：

Selvaraji, Sharmelee et al. “Time-restricted feeding modulates the DNA methylation landscape, attenuates hallmark neuropathology and cognitive impairment in a mouse model of vascular dementia.” Theranostics vol. 12,7 3007-3023. 21 Mar. 2022, doi:10.7150/thno.71815