膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病機制復(fù)雜,手術(shù)難度大,術(shù)后復(fù)發(fā)率高。目前,仍然缺乏有效的治療。lncRNA DDX11-AS1已被證明可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,如肝細(xì)胞癌、食管癌等。然而,其在膠質(zhì)瘤中的分子機制尚不清楚。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中DDX11-AS1的表達(dá)升高,DDX11-AS1高表達(dá)的患者預(yù)后不良。DDX11-AS1是一個潛在的預(yù)后標(biāo)志物。在功能上,DDX11-AS1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移。在機制上,DDX11-AS1與HNRNPC相互作用,促進(jìn)Wnt /b-catenin和AKT途徑以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。綜上所述, DDX11-AS1/HNRNPC軸可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,這為膠質(zhì)瘤的診斷、治療和預(yù)后提供了新的思路和治療靶點。本文于2022年4月發(fā)表于“Molecular Therapy Nucleic Acids”(IF=8.886)上。
技術(shù)路線
結(jié)果
1)DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中上調(diào),高表達(dá)的DDX11-AS1與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良相關(guān)
為了探索DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)模式,我們在GEPIA網(wǎng)站上對TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入分析。由于TCGA數(shù)據(jù)中沒有膠質(zhì)瘤對照組織樣本,通過匹配GTEx數(shù)據(jù),518例低級別膠質(zhì)瘤(LGG)和163例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)中DDX11-AS1的表達(dá)與207例正常樣本相比顯著增加(圖1A)。隨著級別的增加,表達(dá)水平也逐漸增加(圖1B)。通過對GSE4290數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)分析,我們發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中也高表達(dá)(圖1C)。此外,我們收集了26個正常樣本和88個膠質(zhì)瘤,通過實時定量PCR進(jìn)行DDX11-AS1定量分析,結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分析一致(圖1D)。根據(jù)DDX11-AS1表達(dá)水平均勻分布所有膠質(zhì)瘤樣本后,我們發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1低表達(dá)組的總體生存率和無病生存率較高,尤其是在5年內(nèi)(圖1E和1F)。基于TCGA和GTEx膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)的ROC曲線顯示,DDX11-AS1在預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后方面具有較高的準(zhǔn)確性(圖1G)。通過分析CGGA數(shù)據(jù)庫,我們還發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1低表達(dá)的患者預(yù)后更好(圖1H)。這些結(jié)果表明,DDX11-AS1與膠質(zhì)瘤的進(jìn)展有關(guān)。
2)DDX11-AS1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和EMT過程
接下來,我們構(gòu)建了敲低和過表達(dá)的DDX11-AS1細(xì)胞模型,用于細(xì)胞功能實驗。通過transwell和傷口愈合實驗,我們觀察到低表達(dá)DDX11-AS1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力減弱,而高表達(dá)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力增強(圖2A和2B)。此外,DDX11-AS1敲除細(xì)胞中E-鈣粘蛋白的表達(dá)增加,N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)減少(圖2C)。這意味著DDX11-AS1基因敲除抑制了EMT過程;相反,DDX11-AS1過表達(dá)激活了EMT過程(圖2D)。
3)DDX11-AS1增強膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖能力
為了研究DDX11-AS1對細(xì)胞增殖的影響,我們進(jìn)行了體內(nèi)和體外實驗。MTT試驗結(jié)果表明,敲除DDX11-AS1后,T98G和HS683細(xì)胞的增殖能力下降(圖3A)。DDX11-AS1敲除細(xì)胞的集落形成顯著減少,DDX11-AS1高表達(dá)細(xì)胞的集落形成增加(圖3B)。此外,流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,低表達(dá)DDX11-AS1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)量增加(圖3C)。此外,我們還進(jìn)行了體內(nèi)腫瘤形成實驗。我們將DDX11-AS1過表達(dá)的HS683細(xì)胞皮下接種于裸鼠腋窩。腫瘤生長如圖3D所示。DDX11-AS1過表達(dá)細(xì)胞的生長速度更快。IHC結(jié)果顯示,Ki67在過表達(dá)組的表達(dá)水平增加(圖3E)。由于Wnt/b-catenin和AKT途徑與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。我們通過western blot觀察到DDX11-AS1敲除抑制了這兩條途徑,而過表達(dá)激活了這兩條途徑(圖3F和3G)。IHC分析還顯示,DDX11-AS1組的b-連環(huán)蛋白表達(dá)增加(圖3E)。因此,DDX11-AS1促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。
4)DDX11-AS1與HNRNPC相互作用
越來越多的研究表明,細(xì)胞質(zhì)中lncRNA對細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)依賴于蛋白質(zhì)。因此,為了探索DDX11-AS1的潛在結(jié)合蛋白,我們預(yù)測了DDX11-AS1在starBase v.2.0上的結(jié)合RBP,結(jié)果表明DDX11-AS1可以結(jié)合43個RBP。此外,收集T98G細(xì)胞,通過RNA純化和質(zhì)譜分析分離染色質(zhì),鑒定DDX11-AS1結(jié)合的蛋白質(zhì)。與對照組相比,DDX11-AS1特異性結(jié)合208種蛋白質(zhì)。我們主要關(guān)注iBAQ得分前50名的蛋白質(zhì)。在兩組蛋白質(zhì)相交后,只有HNRNPC和PTBP1(圖4A)。由于HNRNPC與DDX11AS1的相互作用更為豐富,HNRNPC被列為后續(xù)機制研究的候選分子。為了驗證DDX11-AS1與HNRNPC的直接結(jié)合,我們使用HNRNPC抗體進(jìn)行了RIP實驗,以拉下與HNRNPC結(jié)合的RNA分子。通過定量實時PCR檢測和分析,與IgG Ctrl組相比,HNRNPC抗體顯著富集DDX11-AS1(圖4B)。此外,我們還分析了TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫中DDX11-AS1和HNRNPC表達(dá)之間的相關(guān)性。DDX11-AS1與HNRNPC呈正相關(guān)(圖4C和4D)。我們還發(fā)現(xiàn),HNRNPC在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),HNRNPC低表達(dá)的患者預(yù)后更好(圖4E–4G)。通過western blot分析,HNRNPC的表達(dá)隨著DDX11-AS1的敲除而降低,HNRNPC的表達(dá)隨著DDX11-AS1的過表達(dá)而增加(圖4H,4I)。此外,我們構(gòu)建了三個用于HNRNPC敲除的siRNA,第三個序列是最好的敲除序列,然后用于后續(xù)實驗(圖4J)。總之,這些數(shù)據(jù)表明DDX11-AS1可以特異性結(jié)合HNRNPC。
5)HNRNPC敲除抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和EMT
我們探討了HNRNPC在膠質(zhì)瘤中的功能作用。敲除HNRNPC后,克隆形成實驗表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力下降(圖5A),傷口愈合實驗表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移減少(圖5B)。這些結(jié)果表明,HNRNPC敲除抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。此外,我們還發(fā)現(xiàn)HNRNPC影響Wnt/b-catenin和AKT途徑以及EMT過程(圖5C)。
6)DDX11-AS1通過HNRNPC促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展
我們試圖探討DDX11-AS1對膠質(zhì)瘤進(jìn)展的影響是否依賴于HNRNPC。在過表達(dá)DDX11-AS1的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步敲除HNRNPC進(jìn)行細(xì)胞增殖和遷移實驗。我們觀察到,通過敲除HNRNPC,DDX11-AS1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的能力減弱(圖6A和6B)。此外,我們還分析了DDX11-AS1/HNRNPC軸在體內(nèi)的作用。結(jié)果表明,HNRNPC敲除減弱了DDX11-AS1對膠質(zhì)瘤生長的促進(jìn)作用(圖6C)。western blot分析表明,HNRNPC敲除降低了DDX11-AS1介導(dǎo)的Wnt/b-catenin和AKT途徑的激活,以及EMT過程(圖6D)。此外,根據(jù)DDX11-AS1和HNRNPC在CGGA膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)情況,將患者分為四組進(jìn)行總體生存分析。如圖6E所示,DDX11-AS1和HNRNPC低表達(dá)的患者生存率最高。
結(jié)論:DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中上調(diào),并與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)。在機制上,DDX11-AS1和HNRNPC的結(jié)合增強了Wnt/b-catenin和AKT途徑以及EMT,從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。DDX11-AS1/HNRNPC軸的發(fā)現(xiàn)有望為膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后提供新的思路。
參考文獻(xiàn):Xiang Z, Lv Q, Zhang Y, Chen X, Guo R, Liu S, Peng X. Long non-coding RNA DDX11-AS1 promotes the proliferation and migration of glioma cells by combining with HNRNPC. Mol Ther Nucleic Acids. 2022, 28:601-612. doi: 10.1016/j.omtn.2022.04.016.