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SRSF3介導的N6-甲基腺苷修飾相關lncRNA ANRIL剪接調控促進了胰腺癌對吉西他濱的耐藥

欄目:最新研究動態 發布時間:2022-06-02
目前,有研究建立了SRSF3、m6A修飾、lncRNA剪接與胰腺癌DNA 同源重組修復(HR)之間的聯系,表明異常的選擇性......


富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子3 SRSF3)調控超過90%的蛋白質編碼基因的mRNA選擇性剪接,為生物多樣性提供了必要的來源。目前,有研究建立了SRSF3m6A修飾、lncRNA剪接與胰腺癌DNA 同源重組修復(HR)之間的聯系,表明異常的選擇性剪接和m6A修飾與胰腺癌化療耐藥密切相關。


技術路線:



主要研究結果

1. 胰腺癌組織中SRSF3表達上調與耐藥有關

首先培養胰腺癌Pan1BXPC3細胞系,通過重復吉西他濱誘導產生耐藥亞群。與相應的親本系相比,吉西他濱在耐藥亞群中的半最大抑制濃度(IC50)值顯著更高(圖1A和圖1B)。在相同吉西他濱濃度下,這些耐藥細胞的增殖速度明顯快于親本細胞,表明成功構建了Panc1-GR-BXPC3-GR-耐藥菌株(圖1C1D)。然后,使用RNA測序(RNA-seq)分析對耐藥和敏感細胞株之間的基因表達譜,以及26名預后較好或較差的晚期胰腺癌患者之間的基因表達譜(圖1E)。SRSF3被鑒定為唯一過表達的剪接基因(圖1F-1H)。

免疫組化數據顯示,SRSF3表達在癌組織中顯著上調(圖1I1J),這與腫瘤分級的增加相關(圖1K)。在相同的化療條件下,SRSF3高表達腫瘤患者的總生存期和無進展生存期明顯短于srsf3低表達腫瘤患者(1L)。qPCRwestern blot數據進一步證實了SRSF3在胰腺癌及相應正常組織中的表達數據(圖1M-1O)。因此,SRSF3高表達腫瘤患者接受化療后預后較差,SRSF3的表達與胰腺癌的化療耐藥密切相關。


1 SRSF3在人胰腺癌中的表達及預后價值


2. SRSF3與胰腺癌細胞吉西他濱耐藥相關

接下來評估SRSF3在吉西他濱耐藥和敏感胰腺癌細胞系中的表達,發現SRSF3蛋白在耐藥胰腺癌細胞中的表達更高(圖2A)。構建四組穩定的細胞系Panc1-CtrlPanc1-SRSF3Panc1-GR-sh載體與Panc1-GRshSRSF3BXPC3-CtrlBXPC3-SRSF3BXPC3-GRsh載體與BXPC3-GR-shSRSF3,以評估SRSF3在介導耐藥性中的作用。western blot數據證實成功產生了不同的表達SRSF3的胰腺癌細胞穩定亞系(圖2B2C)。隨后,平板克隆形成和細胞活力測定數據發現在這些胰腺癌細胞穩定系中,SRSF3的表達確實與吉西他濱耐藥相關(圖2D-2F)。SRSF3的表達被證實可以提高胰腺癌細胞株對吉西他濱的IC50值(圖2E)。

構建SRSF3高低表達的PDX模型,用western blot分析篩選SRSF3高、低表達的組織進行后續移植。裸鼠PDX模型和腹腔腫瘤細胞注射模型數據顯示,SRSF3高表達增強了腫瘤細胞對吉西他濱的耐藥性,而SRSF3低表達則有相反的效果(圖2G-2N)。總之,SRSF3在胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性中起著重要作用。


2 SRSF3增強人胰腺癌細胞體內外吉西他濱耐藥


3. SRSF3lncRNA ANRIL剪接和外顯子包含的調控

為了探究SRSF3的下游分子事件,不同水平的SRSF3表達的胰腺癌細胞進行吉西他濱干預,以確定相關蛋白的表達變化。在吉西他濱處理的細胞中,SRSF3降低了γH2AXp53caspase-3bcl-2的表達,而SRSF3過表達降低了吉西他濱引起的細胞損傷(圖3A)。另外,SRSF3的功能在DNA修復調控中富集(圖3B)。結合圖1G的結果來識別SRSF3的共同差異表達基因以及下游因子:ANRIL是該交叉點唯一與DNA修復相關的基因(圖3C)。利用Ensembl數據庫,根據ANRIL的不同轉錄本設計了引物(圖3D顯示了一些轉錄本圖),并評估了ANRILPanc1Panc1-GRBXPC3BXPC3-GR中的表達。發現吉西他濱耐藥腫瘤細胞主要表達兩種轉錄本:ANRIL 208(簡稱ANRIL- l)和ANRIL 223(簡稱ANRIL- s)(圖3E)。根據ENCORIRNAct數據庫預測,SR家族蛋白SRSF13710具有ANRIL的結合位點(圖3F)。因此,進一步檢測了它們在抗性細胞(GR)和親本細胞(野生型[WT])中的表達。結果顯示,GR細胞中SRSF3表達較高,SRSF10表達較低(圖3G)。RNA免疫沉淀試驗確認了SRSF3SRSF10ANRIL的結合能力(圖3H3I)。RNA下拉試驗發現SRSF3SRSF10能夠與ANRIL結合(圖3J-3L)。通過構建內生ANRIL pre-mRNA與潛在SRSF3-binding站點,執行一個CLIP-qPCR試驗使用Panc-1-GR細胞(圖3M),發現構建攜帶外顯子12的碎片ANRIL能夠綁定到SRSF3蛋白質,而片段包含外顯子26綁定到SRSF10(圖3N)。的RNA免疫沉淀實驗數據顯示,敲低SRSF10SRSF3ANRIL的結合增加(圖3O),而在敲低SRSF3后,SRSF10ANRIL的結合也增加(圖3PS3K)。這表明SRSF3SRSF10競爭性結合ANRIL可調控ANRIL的剪接。SRSF3 SRSF10 或在穩定的腫瘤細胞亞系中顯示 SRSF3能夠上調 ANRIL-L 表達但下調ANRIL-S 表達,而 SRSF10 具有相反的效果(圖 3Q 3R)。這些數據表明 SRSF3 SRSF10 ANRIL 競爭性結合以調節 ANRIL 剪接(圖 3S)。


3 SRSF3誘導ANRIL剪接


4. ANRIL剪接分子的m6A修飾

通過對Panc1-WTPanc1- GR以及Bxpc3-WTBXPC3-GRRNA-seq結果進行GO分析,發現這些基因有m6A修飾(圖4A)。與親本株相比,Panc1-GRBXPC3-GRm6A的總體水平升高(圖4B),這表明修改后的m6A水平可能與吉西他濱耐藥有關。利用m6AvarSRAMP數據庫預測了ANRILm6A的修飾位點(圖4C),并針對ANRIL外顯子1上的m6A位點設計了一套序列特異性的morpholino反義寡核苷酸(MAOS)(圖4D)。使用m6A特異性免疫沉淀試驗評估了Panc1-GR/BXPC3-GR與其親本系之間ANRIL m6A水平的差異(圖4E)。此外,還發現SRSF3表達與ANRIL中的m6A修飾相關(圖4F4G),而METTL3MAOS-ANRIL的過度表達也顯示了ANRILm6A修飾的調控(圖4H4I)。將MAOS-ANRIL轉移到具有穩定敲除SRSF3Panc1-GR細胞系中,發現ANRIL中的m6A修飾水平降低,而在SRSF3敲除后過度表達MAOS-ANRILPanc1-GR細胞中的m6A修飾水平低于對照細胞(圖4J4K)。這些結果表明,SRSF3METTL3ANRILm6A修飾的重要調節因子,這在Panc1-WT細胞中得到了進一步證實(圖4L4M)。這些結果支持了在ANRILSRSF3m6A修飾之間外顯子1m6A位點的重要性。ANRILm6A修飾的水平對于SRSF3ANRIL-L結合至關重要(圖4N4O),并且與ANRIL剪接事件的發生密切相關(圖4P-4S)。總之, ANRILSRSF3表達中m6A修飾水平在ANRIL- l亞型的產生中同樣重要。


4 ANRIL的剪接受m6A RNA甲基化的調控


5. lncRNA ANRIL亞型對吉西他濱耐藥的不同影響

與親本細胞相比,Panc1-GRBXPC3-GR細胞中ANRIL-L表達更高,ANRIL-S表達更低(圖5A)。熒光原位雜交(FISH)實驗顯示,ANRIL-LPanc1-GRBXPC3-GR細胞核中的表達高于Panc1-WTBXPC3-WT(圖5B),而ANRIL-S在細胞核中的表達高于Panc1-WTBXPC3-WT。使用Panc1-WTPanc1-GR生成了穩定的ANRIL-L過表達和ANRIL-S敲除細胞系,并使用qPCR驗證有效轉染(圖5C)。ANRIL-L誘導胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥,而ANRIL-S對耐藥無顯著影響(圖5D-5I)。ANRIL-L也影響腫瘤細胞的DNA損傷修復。結果表明,ANRIL-L能夠下調DNA損傷因子gH2AX的表達,而彗星實驗證實ANRIL-LDNA修復能力密切相關(圖5J5K)。體內裸鼠實驗進一步確認了該體外數據(圖5L-5O)。這些結果總體上證實了ANRIL-l,而不是ANRIL-S,具有調節胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥和增強DNA修復能力的能力,表明不同的ANRIL亞型在胰腺癌細胞中具有不同的功能。


5 lncRNA ANRIL-L亞型對吉西他濱耐藥的影響


6. SRSF3通過調節ANRIL-L的表達促進吉西他濱耐藥

作者通過過表達、敲除等實驗證明了ANRIL-L挽救了SRSF3表達改變的腫瘤細胞對吉西他濱的耐藥性,而ANRIL-S沒有這種作用。western blot和高含量及彗星實驗證實ANRIL-L是影響SRSF3相關DNA修復過程和耐藥性變化的主要因素(圖6O-6R)。綜上所述,SRSF3的表達似乎通過ANRIL選擇性剪接和ANRIL- l的表達增強了胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性。


7. ANRIL-L通過增強DNA HR修復介導吉西他濱耐藥

作者證明了ANRIL-L介導的化療耐藥機制:ANRIL-L通過與RING1bEZH2形成復合體調控胰腺癌細胞的化療耐藥(附圖7A-P)。接下來分析ANRIL-L敲除耐藥細胞中的HRNHEJ,發現這些細胞中的HR活性顯著降低(圖6A6B),并且qPCR數據顯示所選DNA修復RAD50BRCA1BRCA2RAD51 mRNA的水平顯著改變(圖6C)。敲除ANRIL-L表達和吉西他濱治療改變了HR修復相關分子的表達,同時降低了RAD50BRCA1BRCA2RAD51的水平(圖6D)。此外,隨著吉西他濱濃度和耐藥胰腺癌細胞持續時間的逐漸增加,HR分子BRCA1BRCA2RAD50RAD51ANRIL-L的結合增加(圖6E 6H)。然而,在EZH2Ring1B表達被敲除后,與ANRIL-L的結合減弱(圖6I-6L)。在耐藥細胞中敲除ANRIL-L表達后,GH2AXBRCA2BRCA1的結合減少(圖6M-6P)。基于這些結果,ANRIL-L能夠與DNA損傷位點結合,與EZH2Ring1B形成復合物,進而招募RAD50BRCA1BRCA2RAD51蛋白,在細胞經歷DNA損傷修復時促進DNA HR修復過程。


6 ANRIL-L復合物通過增強DNA HR修復介導吉西他濱耐藥


8. 胰腺癌組織中SRSF3的表達與ANRIL剪接、Ring1BEZH2的表達相關

與正常組織相比,胰腺癌組織中ANRIL- l表達水平較高,ANRIL- s表達水平較低(圖7A7B),胰腺癌組織中ANRIL外顯子1包涵水平顯著高于非癌胰腺組織(圖7C)。結合臨床預后分析,Kaplan-Meier分析顯示高PSI-ANRIL-exon 1腫瘤預后較差(圖7D7E)。相比之下,高PSI-ANRIL -1外顯子的患者比低PSI ANRIL-L的患者有更多的淋巴結轉移和更大的腫瘤(圖7F7G)。此外,SRSF3的表達與METTL3存在相關性,證實了SRSF3m6A修飾之間的相關性(圖7H)。ANRIL外顯子1內含物PSI與腫瘤組織中SRSF3EZH2Ring1B的表達相關,進一步支持了這些因子形成復合物調控DNA修復的可能性(圖7I-7K)。這些數據表明胰腺癌組織中SRSF3表達、ANRIL剪接以及Ring1BEZH2表達之間存在相關性。


7胰腺癌組織中SRSF3表達與ANRIL剪接、Ring1BEZH2表達的相關性


結論:

綜上所述,本研究揭示了SRSF3在胰腺癌化療耐藥調控中的作用及其與胰腺癌預后的關系。SRSF3表達通過ANRIL剪接使胰腺癌細胞對化療藥物脫敏,ANRIL中的m6A甲基化對剪接過程至關重要。證明了SRSF3SRSF10在調節lncRNA ANRIL可變剪接模式中的作用。此外,m6A甲基化對于lncRNA的剪接過程至關重要。該研究不僅提供了SRSF3誘導ANRIL-L剪接的分子機制,進而在胰腺癌化療耐藥性中形成DNA HR修復復合體,而且還為未來胰腺癌治療的發展提供了一種策略。