胰腺導管腺癌（PDAC）是胰腺癌的主要類型，是最具侵襲性和致命性的消化道惡性腫瘤，預后極差。PDAC的嚴重預后與腫瘤微環境（TME）相關，其中組織相關的巨噬細胞（TAM）是PDAC TME中主要的免疫細胞。目前，有研究發現LncRNA-PACERR是PDAC TME中TAMs的關鍵調控因子，并揭示了其在細胞質和細胞核中的新機制。該研究于2022年5月7日發表在《Journal of Hematology & Oncology》，IF：17.388。

技術路線：

主要研究結果：

1. LncRNA-PACERR在TAMs中過表達，PACERR+ TAMs浸潤升高與PDAC患者預后不良相關

為了確定PDAC中TAMs中LncRNA-PACERR的表達水平，使用磁激活細胞分選（MACS）從46名PDAC患者的癌旁組織中分離出CD163+細胞和CD80+細胞，這些巨噬細胞的體積為0.5 cm³。通過流式細胞儀分析確保了分選細胞的高純度（圖1b）。對腫瘤組織和非腫瘤組織組成的PDAC組織微陣列（TMAs）的FISH免疫熒光分析表明，LncRNA-PACERR在TAMs中的表達明顯高于正常組織常駐巨噬細胞（M1-NTRMs） （圖1c，d），并且CD163和LncRNA-PACERR之間存在很強的共定位關系（圖1e）。Kaplan-Meier分析顯示LncRNA-PACERR⁺ TAMs高浸潤與PDAC預后不良相關 （圖1f）。綜上所述，這些結果表明LncRNA-PACERR⁺ TAMs越多，PDAC預后越差。

圖1 TAMs中LncRNA-PACERR表達在PDAC組織中被激活，與預后不良相關

2. LncRNA-PACERR⁺ TAMs具有M2極化巨噬細胞的特征，在體外和體內均能促進胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲

為了明確PACERR的功能，利用THP-1細胞系和PATU-8988/PANC-1細胞構建TAMs體外共培養模型（圖2a）。qPCR分析證實，TAMs敲除LncRNA-PACERR后，M2巨噬細胞標志物CD206、CD163、Arginase-1、TGF-β、IL-10、IL-6表達水平下調（圖2a）。流式細胞術顯示，THP-1來源的TAMs中LncRNA-PACERR表達減少，導致CD206+和CD163+巨噬細胞比例降低（圖2b）。基于克隆形成和CCK8實驗，TAMs中LncRNA-PACERR敲低可抑制胰腺癌細胞增殖（圖2c）。Transwell實驗表明TAMs中LncRNA-PACERR增加了胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力（圖2d， e）。用兩組小鼠來展示小鼠的預后，觀察到LncRNA-PACERR敲低組小鼠的總生存期較陰性對照組小鼠更長（圖3a-e）。對于轉移小鼠模型，其皮下腫瘤模型和轉移性肝細胞數量減少，CD163+細胞的數量和CD206 +細胞轉移焦點在TAMs中LncRNA-PACERR敲除后降低（圖3h-f）。

圖2 LncRNA-PACERR的敲低在體外抑制THP -1衍生的TAMs的M2極化和促腫瘤功能

圖3在體內LncRNA-PACERR⁺ TAMs促進PDAC細胞生長和肝轉移

3. LncRNA-PACERR通過吸附miR-671-3p上調KLF12/p-AKT/c-myc軸

LncRNA-PACERR促進惡性腫瘤進展的分子機制：通過FISH和細胞分離實驗確定了LncRNA-PACERR的亞細胞位置，揭示了LncRNA-PACERR在TAMs細胞質和細胞核中的主要分布（圖4a-d）。qPCR檢測了兩個假定的LncRNA-PACERR靶標miRNA （miR-4448和miR-671-3p） （圖4e）。在THP-1衍生的TAMs中，敲低LncRNA-PACERR后，miR-671-3p上調，而miR-4448未發生變化（圖4e）。因此選擇miR-671-3p進行進一步研究。作者發現LncRNA-PACERR對pri-miRNA或pre-miRNA的表達或啟動子活性沒有顯著影響（圖4f-h）。RIP結果顯示，AGO2顯著結合LncRNA-PACERR和miR-671-3p（圖4i）。雙熒光素酶報告基因檢測確定了miR-671-3p與LncRNA-PACERR的相互作用（圖4j，k）。此外，利用臨床樣本檢測LncRNA-PACERR和miR-671-3p的表達，發現miR-671-3p在TAMs中的表達低于M1-NTRMs，并且與LncRNA-PACERR呈負相關（圖4i， m）。為評估miR-671-3p的臨床預后，對PDAC TMAs的患者進行分組，分為miR-671-3p⁺高組和miR-671-3p⁺低組（圖4n）。Kaplan-Meier分析顯示，miR-671-3p表達越高，PDAC的預后越好（圖4n）。另外，作者對PDAC中報道過的最著名的靶基因KLF12，進行了確認（圖5a）。qPCR分析和IF分析證實，KLF12在TAMs中高表達，與不良預后相關（圖5b）。為了探究miR-671-3p是否可以直接海綿化KLF12，首先測定PDAC樣本中miR-671-3p的RNA表達水平，發現KLF12與miR-671-3p之間存在負相關 （圖5c）。此外，在THP-1衍生的TAMs中，轉染miR-671-3p模擬物后KLF12 mRNA表達水平降低，轉染miR-671-3p抑制劑后KLF12 mRNA表達水平升高（圖5d）。雙熒光素酶報告基因檢測顯示，用miR-671-3p模擬物轉染HEK-293 T細胞后，Luc-KLF12-wt組的熒光素酶活性降低，而Luc-KLF12-mut組的熒光素酶活性沒有變化（圖5e， f）。此外，在TAMs中，KLF12的表達與LncRNA-PACERR的表達水平呈正相關（圖5g）。轉染miR-671-3p抑制劑后，LncRNA-PACERR敲低，可挽救THP-1中KLF12的表達（圖5h， i）。轉染LncRNA-PACERR過表達質粒增加了Luc-KLF12-wt的熒光素酶活性，轉染LncRNA-PACERR和miR-671-3p模擬物減弱了HEK-293 T的這種作用（圖5j）。western blot分析顯示LncRNA-PACERR調控KLF12顯著促進AKT磷酸化，通過下調THP-1衍生的TAMs中的PTEN增加c-myc的表達（圖5k， l）。qPCR、流式細胞術、CCK8、集散形成和Transwell實驗得到與LncRNA PACERR相似的結果，并且過表達KLF12可以促進LncRNA-PACERR的表達（圖5m）。綜上所述，LncRNA-PACERR可以通過隔離miR-671-3p來釋放KLF12，從而通過KLF12/AKT/c-myc通路實現TAMs促進胰腺癌惡性進展。

圖4 LncRNA-PACERR在TAMs中作為ceRNA海綿作用于miR-671-3p

圖5 MiR-671-3p直接結合KLF12的3'UTR，調控KLF12/AKT/c-myc軸

4. KLF12/LncRNA-PACERR復合物通過招募EP300來促進LncRNA - PACERR在細胞核內的轉錄

根據圖5m推測KLF12可能促進LncRNA-PACERR在細胞核內的轉錄。通過ChIP實驗確定KLF12與TAMs中LncRNA-PACERR啟動子區結合（圖6a）。根據KLF12的motif預測了LncRNA-PACERR啟動子區域的結合位點，發現KLF12結合在LncRNA-PACERR上游的-302—+ 100bp處（圖6b-d）。鑒于大多數轉錄因子通過影響組蛋白修飾來調控基因轉錄，因此通過ChIP分析確定KLF12在TAMs中LncRNA-PACERR的TSS處增加了H3K27ac的富集（圖6f）。因此，co-IP實驗驗證了KLF12會招募組蛋白乙酰轉移酶EP300 （圖6g）。RNA-pull down和RIP實驗驗證KLF12會與細胞核內的LncRNA-PACERR結合 （圖6h， i）。綜上所述，這些數據表明LncRNA-PACERR也直接受到KLF12的轉錄調控。

圖6 KLF12直接與LncRNA-PACERR結合，并以LncRNA-PACERR依賴的方式將EP300招募到LncRNA-PACERR啟動子區域

5. LncRNA-PACERR在TAMs中通過與IGF2BP2協同發揮致癌作用

首先通過RNA-pull down和質譜分析來篩選出于LncRNA-PACERR相互作用的m6a相關蛋白-IGF2BP2（圖7a）。然后，進一步驗證了IGF2BP2作為LncRNA-PACERR的RNA結合蛋白（圖7b）。另外，RIP實驗也證實了IGF2BP2與LncRNA-PACERR之間的關系（圖7c）。此外，THP-1驅動的TAMs中LncRNA-PACERR FISH和IGF2BP2的共定位分析支持了它們的相互作用（圖7d）。RNA pull-down和western blot分析確定LncRNA-PACERR的1-293nt區域與IGF2BP2相互作用（圖7e， f）。最后，構建了含有標記截短和全長IGF2BP2的HEK-293 T細胞，并通過RIPqPCR檢測發現，KH1和KH2結構域對LncRNA-PACERR的招募具有決定性作用（圖7g，h）。而qPCR、western blot、FISH和IF檢測，LncRNA-PACERR和IGF2BP2彼此的表達水平并不改變（圖7d， j， k）。這些結果表明LncRNA-PACERR與IGF2BP2存在物理結合作用。

圖7 TAMs中LncRNA-PACERR直接與IGF2BP2結合

6. LncRNA-PACERR通過與IGF2BP2協同提高KLF12和c-myc的mRNA穩定性

由于KLF12和c-myc作為LncRNA-PACERR的下游靶點，推測LncRNA-PACERR是否與IGF2BP2共同調控KLF12和c-myc的穩定性。為了證實這一假設，首先使用qPCR和western blot分析來闡明LncRNA-PACERR/IGF2BP2對KLF12和c-myc表達的正向調控作用（圖8a，b）。放線菌素D發現，IGF2BP2敲除消除了LncRNA-PACERR過表達增加的KLF12和c-myc的穩定。LncRNA-PACERR敲除通過IGF2BP2過表達解除了KLF12和c-myc的半衰期（圖8c-f）。為了進一步闡明KLF12和c-myc是否被m6A甲基化修飾，使用基于GGAC m6A核心基序的m6A RIP qRT-PCR分析表明，在甲基轉移酶樣14（METTL14）敲除THP-1細胞中，KLF12轉錄本3'UTR的m6A甲基化和c-myc轉錄本的編碼區不穩定決定簇（CRD）區域降低（圖8g）。為了探究LncRNA-PACERR是否影響IGF2BP2與KLF12和c-myc m6a修飾區域的結合，通過RIP-qPCR檢測，LncRNA-PACERR敲低顯著降低了IGF2BP2與KLF12和c-myc m6a修飾區域的結合（圖8h， i）。鑒于IGF2BP2調節的m6A修飾區域主要位于mRNA 3'UTR的起始點，因此構建KLF12 3'UTR的熒光素酶報告載體，然后通過RIP-qPCR驗證野生型報告基因中IGF2BP2和m6A比突變報告基因中富集（圖8j-l）。此外，雙熒光素酶報告分析顯示，LncRNA-PACERR增加了KLF12-3'UTR野生型報告基因中的熒光素酶活性，與IGF2BP2的結果相似（圖8m）。這些數據表明，LncRNA-PACERR與IGF2BP2合作，增強了KLF12和c-myc在TAMs中的穩定性。

圖8 LncRNA-PACERR與IGF2BP2以m6a依賴的方式共同調控KLF12和c-myc

結論：

LncRNA-PACERR通過兩個途徑促進胰腺癌的惡性進展:作為ceRNA海綿體的miR-671-3p激活KLF12/ AKT/c-myc通路，并與IGF2BP2相互作用增強KLF12和c-myc的穩定性。同時，KLF12轉錄的LncRNA-PACERR與KLF12直接相互作用，KLF12/PACERR復合物通過招募EP300激活LncRNA-PACERR轉錄，從而促進TAMs中的M2極化和腫瘤前功能。