乳腺癌是全世界女性中最常見的癌癥。大約50-70%的乳腺癌晚期患者發生骨轉移，導致骨骼相關事件，包括疼痛、病病性骨折、脊髓受壓、高鈣血癥和其他并發癥。在本研究中，作者探討了骨轉移的分子機制，可能為骨轉移患者提供額外的治療策略。本文于2022年5月發表于《Nature communications》, IF=12.121。

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本文主要內容：

1. EZH2促進乳腺癌骨轉移，EZH2甲基轉移酶抑制劑不能阻止這一過程

為了探討EZH2在乳腺癌骨轉移中的作用，作者構建了EZH2敲除細胞系1566.shEZH2及其對照細胞系1566.shScr。與注射1566.shScr細胞的小鼠相比，注射1566.shEZH2的小鼠無骨轉移生存期和總生存期更長(Fig. 1a)。 生物發光成像(BLI)、x射線成像和蘇木精和伊紅(H&E)染色均顯示出相同的結果(Fig. 1b)。

使用CRISPR/CAS9系統，生成了ezh2敲除的MDA-MB-231細胞亞克隆(231.KO)及其對照克隆 (231.sgCtrl)。其中的231.KO#1與野生型EZH2(231.KO# 1.EZH2) 或pLenti對照載體(231.KO#1.pLenti)中穩定表達。231.KO# 1.EZH和231.KO#1.pLenti)分別注射到小鼠中，注射231.KO#1.EZH2的細胞用載體或GSK126處理，GSK126是一種有效的EZH2小分子甲基轉移酶抑制劑，而對照組小鼠注射231.KO#1.pLenti治療。結果表明，231.KO#1.EZH2組無骨轉移生存率明顯低于231.KO#1.pLenti組(Fig. 1c, d)。出乎意料的是，gsk126處理的231.KO#1.EZH2組無轉移生存率與vehicle處理的231.KO#1.EZH2 組相似(Fig. 1c, d)。與對照組相比，注射1566.KO細胞的小鼠無轉移生存期和總生存期均顯著延長 (Fig. 1e,f)。對照細胞組小鼠在無骨轉移生存期、總生存期方面，與EPZ-6438組之間沒有顯著差異(Fig. 1e, f）。在體外實驗中，高表達ezh2的細胞比低表達ezh2的細胞具有更強的遷移和侵襲能力(Fig. 1g）。與對照231.KO#1相比，野生型EZH2的重表達(231.KO#1. ezh2)顯著提高了細胞遷移和侵襲能力。此外，與注射231.KO#1.pLenti細胞的對照組相比，野生型EZH2的重表達(231.KO#1.EZH2)顯著增加細胞遷移和侵襲(Fig. 1h)。

Fig1 EZH2促進乳腺癌骨轉移，EZH2甲基轉移酶抑制劑不能阻止這一過程

2.  EZH2調節乳腺癌骨轉移的惡性循環

乳腺癌細胞與RAW264.7破骨前體細胞和MC3T3成骨細胞共培養(Fig. 2a)。共培養六天，與MDA-MB-231 和 231.sg對照細胞相比，sezh2基因敲除的231.KO # 1和231.KO#2細胞的生長明顯受到抑制(Fig. 2b)。與EZH2敲除的細胞共培養時，與MDA-MB-231 和 231.sg對照細胞相比，成熟破骨細胞的前體破骨細胞RAW264.7明顯減少（Fig. 2c)。與231.KO#1相比，231. ko # 1.H689A細胞重新表達H689A促進了腫瘤細胞增殖和破骨細胞成熟(Fig. 2d, e)。靜脈注射231.KO#1.EZH2和231. ko # 1.H689A細胞轉染小鼠，觀察骨轉移生長情況，發現231.KO#1.EZH2和231. KO # 1.H689A細胞誘導骨轉移病變(Fig. 2f)。PTHLH是乳腺癌骨轉移的介質。通過qRTPCR檢測，在MDA-MB-231和4T1細胞中敲除EZH2可以降低TGFβ處理下的PTHLH mRNA表達, 而GSK126處理4T1細胞并沒有降低Pthlh mRNA的表達(Fig. 2g, h).

Fig2 EZH2調節乳腺癌骨轉移的惡性循環

3. FSP1EZH2在TGFβ刺激下增加pS465/467-Smad2和pY397-FAK水平

PTHLH是一個眾所周知的TGFβ下游基因，受p-Smad2/Gli2轉錄因子復合體或p38 mapk7,23調控。為了進一步探索EZH2是如何促進乳腺癌細胞中PTHLH和TGFβ信號轉導的，作者檢測了乳腺癌細胞中pS465/467-Smad2和pT180/Y182-p38 MAPK水平。在TGFβ刺激下，MDA-MB-231細胞敲除EZH2可抑制pS465/467-Smad2水平，但Smad2、Smad3、Smad4蛋白水平沒有顯著變化(Fig. 3a)。與對照載體相比，H689A EZH2重表達也增加了pS465/467-Smad2的水平(Fig. 3b)。敲除ezh2基因后進行反向蛋白芯片分析，結果顯示，顯著下調和上調的蛋白為激酶，包括酪氨酸激酶(Fig. 3c)。值得注意的是，FAK上酪氨酸397的磷酸化水平(pY397-FAK)顯著降低(Fig. 3c)。通過WB驗證了RPPA數據，結果顯示，在MDA-MB-231和MCF7細胞中敲除EZH2可以抑制TGFβ處理下的pY397-FAK和pS465/467-Smad2水平(Fig. 3d)。

為了檢查pY397-FAK的增加是否與pS465/467-Smad2的增強有關，作者用不同濃度(1-10 μM)的FAK抑制劑(FAKi、VS-4718或VS-6063)，再經TGFβ處理(5 ng/ mL, 2 h) MDA-MB-231細胞，檢測pS465/467-Smad2。結果發現FAKi降低了pS465/467-Smad2水平，甚至在TGFβ刺激下也降低了PTHLH mRNA的表達 (Fig. 3e)。此外，在MDA-MB-231細胞中使用shRNAs敲除FAK (shFAK#2或shFAK#3)也能抑制pS465/467-Smad2的水平(Fig. 3f)。

Fig3 EZH2在TGFβ刺激下增加pS465/467-Smad2和pY397-FAK水平

4. pY397-FAK誘導TGFβ ri酪氨酸磷酸化，增強其與TGFβ rii的結合，以響應TGFβ

在mda - mb - 231細胞中，評估FAK是否調控TGFβRI和TGFβRII的表達。發現無論有無TGFβ暴露，FAK IP均可降低TGFβRI，而非TGFβ RII (Fig. 4a)。此外，通過FAKi VS-4718處理阻斷FAK激酶活性，降低了FAK與TGFβRI的結合(Fig. 4b)。TGFβRII的WB結果顯示FAK抑制顯著降低了TGFβRI與TGFβ RII的結合，以響應TGFβ的刺激(Fig. 4c)。此外，作者檢測到TGFβRI上的酪氨酸磷酸化， FAKi VS-6063處理降低了酪氨酸磷酸化(Fig. 4d)。接下來，作者發現了一個未報道的酪氨酸182 (pY182)上的TGFβRI磷酸化位點，位于甘氨酸和絲氨酸殘基富集區域(Fig. 4e)。

結構分析顯示，TGFβRI的Y182位點高度暴露于潛在的磷酸化(Fig. 4f)，靠近TGFβRI的兩個蘇氨酸位點和一個絲氨酸位點(T185、T186、S187) (Fig. 4g)，它們被TGFβRII31和32結合并磷酸化。蛋白質對接結果表明，TGFβRI的Y182指向TGFβRII的K381（Fig 4g）。

Fig 4 pY397-FAK誘導TGFβ ri酪氨酸磷酸化，增強其與TGFβ rii的結合，以響應TGFβ

5. EZH2增加FAK上游ITGB1的表達

作者發現，敲除EZH2導致RNA Pol II與ITGB1(編碼整合素β1)啟動子的結合顯著降低，而與ITGB3(編碼整合素β3)的結合變化不大(Fig. 5a）。qRT-PCR顯示敲低或敲除EZH2下調ITGB1 mRNA表達(Fig. 5b, c)。同時,ITGB1啟動子驅動的熒光素酶報告基因檢測顯示，與與231.KO#1 和 231.KO#2相比，ezh2表達的MDA-MB-231 和 231.sgCtrl 細胞ITGB1啟動子活性較高(Fig. 5d)。

ChIP-qPCR中，使用一系列的PCR引物結合到ITGB1啟動子的不同區域，結果發現在MDA-MB-231細胞中，EZH2被招募到ITGB1啟動子從P1到P5位點，預期在231.EZH2與ITGB1啟動子位點的結合缺失（Fig. 5e）。在MDA-MB-231細胞中。EZH2敲除后，RNA Pol II與ITGB1啟動子的結合也失去了(Fig. 5f)。類似地，在231.shEZH2#3 和231.shEZH2#4細胞中敲低EZH2能降低ITGB1啟動子P1到P4位點的RNA Pol II結合(Fig. 5g)。

Fig5 EZH2增加FAK上游ITGB1表達

6.  臨床適用的FAK抑制劑能阻斷治療ezh2誘導乳腺癌骨轉移

使用BLI檢測產生的骨轉移生長，這證實了GSK126治療沒有阻止骨中的腫瘤生長. 令人興奮的是，與對照組相比，FAKi VS-6063治療顯著阻礙了骨腫瘤的生長(P = 0.0442)(Fig 6a)。骨轉移免疫組化染色顯示FAKi VS-6063顯著降低pS465/467-Smad2水平(P = 0.0066)和骨轉移灶中PTHLH表達(P = 0.0074)，兩種藥物均有效抑制其靶點(Fig. 6b, c)。最后，作者檢查了GSE2603數據集并驗證了EZH2表達與乳腺癌患者無骨轉移生存期呈負相關(r =?0.2394，P = 0.03) (Fig. 6d), 提示EZH2在原發性乳腺腫瘤中的高表達會導致患者發生骨轉移的高風險。作者還研究了EZH2表達與下游效應因子的相關性，GSE14020數據集中乳腺癌患者骨轉移組織中PTHLH的含量。作者發現骨轉移患者中EZH2 mRNA表達與PTHLH mRNA表達呈正相關(Fig. 6e)

Fig6臨床適用的FAK抑制劑治療阻斷ezh2誘導的乳腺癌骨轉移

    綜上所述，作者發現FAK是EZH2在乳腺癌骨轉移惡性循環中的下游效應因子。發現FAKi聯合標準的抗骨吸收藥物、化療或放療可能為骨轉移的乳腺癌患者提供額外的好處。