宮頸癌（cervical cancer ，CC）是女性最常見的惡性腫瘤之一， PD-1及其配體PD-L1相互結合啟動T細胞的程序性死亡，使腫瘤細胞獲得免疫逃逸。派姆單抗(pembrolizumab)是PD-1和PD-L1 抑制劑，已被批準用于CC，但仍有大量患者表現出先天耐藥性。免疫檢查點抑制劑是免疫治療新方式，使用免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint blockade ，ICB)聯合治療能克服耐藥性，提高治療效果。為了確定靶向哪些受體，并確定最佳的抗體組合，帶來更好地治療效果，作者對受體在免疫細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)亞群上表達進行了研究。這篇文章2022年2月發表于《Journal for Immuno Therapy of Cancer》，IF=11.367。

本文技術路線：

主要結果：

1.對PD-1阻斷不敏感的CC患者表現出CD8+ til細胞CD96高表達

為建立抗PD-1治療模型，從14例手術切除的宮頸癌腫瘤組織中分離出單細胞懸液，并派姆單抗或免疫球蛋白作為對照處理腫瘤懸液24小時（Fig1A）。與對照組相比，派姆單抗治療后細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應和腫瘤細胞凋亡均有所增加，且增加1.5倍以上的標本被認為是敏感的。結果顯示，在14例標本中有4例產生了有效的檢查點抑制（Fig1B）。4個敏感和10個耐藥的樣本檢查免疫檢查點的表達情況，結果顯示不敏感的宮頸癌樣本的CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞中Tim-3和CD96顯著升高（Fig1C）。從耐藥患者身上收集了原發手術腫瘤樣本，利用免疫熒光實驗技術，作者觀察到耐藥的CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞中CD96廣泛表達（陽性比率76.8%）（Fig1D）。為了確定CD96+ CD8+ T細胞豐度對宮頸癌的影響，通過TCGA數據庫發現CD96+ CD8+ T與CD96- CD8+ T的比例越高，生存率越低（Fig 1E）。這些數據表明CD96+ CD8+ T細胞在CC腫瘤逃逸中起關鍵作用。

Fig1. CC患者CD8+ TIL上ir的表達與pembrolizumab應答的關系

2.  CD96在瘤內CD8+ 細胞中上調并與PD-1共表達

接下來，他們收集了15個瘤內組織樣本（IT）、5個配對的PT（瘤外組織）和血液樣本，進一步探索CD96在宮頸癌PD-1阻斷中的作用。結果發現血液中CD8+ T細胞中PD-1和CD96的表達極低。與瘤外樣本相比，瘤內樣本CD8+ T細胞中CD96和PD-1的表達顯著升高（Fig 2A）。流式細胞圖顯示，在瘤內和瘤周的組織中，表達CD96的CD8+ T細胞通常同時表達PD-1（Fig 2B）。對派姆單抗不敏感的患者中，同時表達PD-1和CD96的CD8+ TIL比僅表達CD96的CD8+ TIL更常見（Fig 2C）。雖然敏感患者CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞上CD96的表達低于不敏感患者，但CD96+ PD-1+ 細胞百分比是CD96- PD-1+細胞百分比的兩倍。總的來說，來自CC患者的CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞中CD96表達上調，并且大多數CD8+ TIL共表達CD96和PD-1。

Fig2. CD96和PD-1在CD8+TIL上的共表達

3. CD96+ PD-1+ CD8+ TIL 表現出終末耗竭效應表型

為了解CD96+ PD-1+ CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞的分化狀態，接下來了檢測癌組織中CD45RA和CCR7的表達。根據CD45RA和CCR7的表達水平，T細胞分為以下四類：初始T細胞、中樞記憶T細胞、效應記憶T（Tem）細胞和終末分化效應記憶T（TEMRA）細胞。結果顯示CD96+ PD-1+ CD8腫瘤浸潤淋巴細胞中TEMRA含量最高（Fig 3A）。耗竭已成為癌癥患者T細胞功能障礙的公認模式。他們進一步研究了TIM-3和PD-1在耗竭CD8+ TIL上的表達模式。雙陰性的CD8+ TIL幾乎不表達Tim-3；CD96或PD-1陽性的CD8+ TIL的Tim-3表達上調；CD96+ PD-1+ CD8+ TIL的Tim-3+細胞比例最高，提示CD96和/或PD-1陽性的CD8+ TIL具有耗竭的表型（Fig 3B）按CD96和PD-1劃分的CD8+ TIL亞組中eome陽性細胞比例差異無統計學意義。CD96 或 PD-1 單陽性細胞表現出 TCF-1 的顯著上調。相反，雙陰性和雙陽性細胞表達少量的TCF-1,表明CD96? PD-1+ CD8+ TIL表現出干細胞樣的前體耗竭T細胞特征（Fig 3C）。此外，淋巴細胞脫顆粒標記物在單陽性和雙陽性細胞上的表達顯著降低（Fig3D）。三種效應細胞因子的細胞比例在雙陰性 CD8+ 腫瘤浸潤細胞中高表達，而IL-2+、IFN-γ+和TNF-α+細胞的百分比在CD96+和/或PD-1+ TIL中下降且相似（Fig 3E）。與雙陰性細胞相比，CD96+ PD-1? 和CD96? PD-1+ CD8+ TIL的細胞溶解蛋白GZMB和PrF1的表達降低（Fig3F）。而CD96+ PD-1+ CD8+ TIL的PRF1表達低于單個陽性細胞，而GZMB表達顯著高于單個陽性細胞。這些結果表明，CD96 PD-1雙陽性的CD8+ TIL具有內在的終末耗竭效應表型。而CD96? PD-1+ CD8+ TIL具有更多的前體衰竭樣表型。

           Fig3. CD96+ PD-1+ CD8+ TIL上的記憶、轉錄和功能分子的表征。

4. CD96阻斷增強PD-1阻斷體外釋放CD8+TIL功能

接下來，他們通過檢測CD8+ TIL的增殖、細胞因子的產生和脫顆粒來評估CD96阻斷是否促進了CD8+ TIL的抗腫瘤反應。與單一阻斷組相比，雙重阻斷組的IFN-γ+ CD8+ TIL數量顯著增加（Fig 4B）。同樣，雙重阻斷促進CD8+ 腫瘤浸潤細胞的增殖，Ki67+ 細胞比例顯著高于對照組和單一阻斷組（Fig 4C）。PD-1和CD96聯合阻斷導致的細胞毒性標志物（CD107a、GZMB和PRF1）明顯高于單獨阻斷（Fig 4D）。在PD-1和CD96阻斷的24小時之后評估PD-1和CD96的表達。CD96阻斷對CD8+ TIL中PD-1的表達無影響，提示靶向CD96后受體未受調節（Fig 4E）。相反，他們觀察到在PD-1阻斷后，大多數受試患者的CD8+ TIL中CD96表達明顯上調。這些結果可能表明在阻斷PD-1期間CD8+ TIL具有了PD-1抵抗的表型，并為PD-1和CD96聯合阻斷提供了理論依據。

Fig4. PD-1和CD96體外阻斷治療后CD8+TIL功能恢復

5. CC患者CD226/CD96/TIGIT信號通路平衡被打破

CD226、CD96和TIGIT共同形成了一個形成免疫應答的途徑，其中CD96和TIGIT傳遞抑制信號，而CD226傳遞激活信號。作者推測這兩條信號通路在宮頸癌患者中免疫平衡可能被破壞，從而達到只激活或抑制的作用。

首先分析三個因子在宮頸癌患者血液、腫瘤組織和瘤旁樣本的CD8+ T細胞中的表達。在腫瘤中，CD96+和TIGIT+亞群的比例顯著增加，而在CD8+ TILs中CD226+細胞亞群顯著減少。表明CD226+ CD8+ T細胞在腫瘤微環境的影響下可能向CD96+和TIGIT+ CD8+ T細胞轉變（Fig 5A）。接下來，他們評估了CD155的表達。在血液中，樹突細胞和單核細胞中CD155細胞高表達。 瘤周細胞中CD155+細胞的比例較低，而腫瘤細胞中CD155+細胞的比例顯著升高（Fig 5B）。 免疫組織化學和免疫熒光實驗進一步證實CD155在瘤內組織中廣泛表達，而在瘤周組織中低表達。在對αPD-1敏感和不敏感的腫瘤標本中比較顯示，CD155表達在各組之間沒有差異（Fig5 C、E和F）。總之，他們的發現顯示CD8+ 腫瘤浸潤細胞中，CD226/CD96/TIGIT信號通路的不平衡可能導致CD96在宮頸癌中發揮負免疫調節作用。

Fig5. CC患者CD226/CD96/TIGIT信號失衡

6.CD96阻斷增強PD-1阻斷聯合治療的治療活性

接下來，作者以C57BL/6小鼠為模型，探討CD96阻斷對體內腫瘤進展的影響(Fig 6A)。發現每周注射兩次CD96或αPD-1顯著延緩腫瘤生長并延長荷瘤小鼠的存活。此外，與單一阻斷相比，聯合治療效果更佳(Fig6 BC)。免疫組化證實了αCD96或αPD-1具有顯著的抑瘤活性且當聯合治療時具有較好的協同作用(Fig 6D)。在小鼠模型中，我們觀察到PD-1抑制劑治療的小鼠CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞中CD96表達顯著上調，但CD96阻滯劑或兩種阻滯劑聯合治療的小鼠未見明顯上調。此外，單獨阻斷PD-1和CD96不影響CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-1的水平，但雙重阻斷顯著下調PD-1的表達。這些結果支持PD-1的臨床靶向與CD96阻斷具有協同效應(Fig 6E)。接下來在小鼠中研究了CD96和PD-1阻斷對CD8+ 腫瘤浸潤細胞功能的影響。分析了產生效應細胞因子或細胞溶解蛋白的CD8+ TIL的百分比。與體外模型實驗結果一致，單獨阻斷后CD107a和PRF1的表達較對照組增加，雙阻斷治療進一步增強刺激效應。?INF-γ、GZMB和TNF-α在雙阻斷治療后有升高的趨勢，但差異無統計學意義（Fig 6F）。

Fig6. CD96和PD-1聯合阻斷可促進TC-1荷瘤C57BL/6小鼠的抗腫瘤免疫

對PD-1阻斷不敏感的CC患者常表現為CD96表達增加。在瘤內CD8+ T細胞中CD96和PD-1大部分存在共表達。表型分析顯示， PD-1或CD96單陽性細胞表現前體耗竭樣表型，而PD-1和CD96共表達的CD8+TIL多表現為終末耗竭的效應表型。此外，CD8+ T細胞中CD96/TIGIT/CD226信號通路破壞。表明CD96在CD8+ T細胞功能和PD-1抵抗中起免疫調節作用。在臨床模型中，CD96通過增強抗腫瘤CD8+ TIL功能來增強PD-1的阻斷作用，為宮頸癌的治療提供了理論基礎。

參考文獻：

Wang, Y., et al., Targeting CD96 overcomes PD-1 blockade resistance by enhancing CD8+ TIL function in cervical cancer. J Immunother Cancer, 2022. 10(3).