FSTL1被廣泛認為是一種分泌糖蛋白，但其在肝纖維化過程中調節巨噬細胞相關炎癥的作用尚未被證實。在此，我們的目標是描述巨噬細胞FSTL1在肝纖維化發展中的作用。人和小鼠纖維化肝臟巨噬細胞中FSTL1的表達均顯著升高。骨髓特異性FSTL1缺失可有效減緩肝纖維化的進展。在FSTL1^{M- KO}小鼠中，肝纖維化過程中形成的微環境炎癥反應相對較少。在體內和體外，FSTL1^{M- KO}巨噬細胞表現出M1極化抑制和NF-κB通路激活的抑制。此外，本研究還表明，FSTL1通過其FK結構域直接與PKM2結合。有趣的是，FSTL1促進PKM2磷酸化和核易位，減少PKM2泛素化以增強PKM2依賴的糖酵解，增加M1極化。PKM2的藥理激活部分緩解了FSTL1介導的糖酵解和炎癥反應。本文于2022年1月發表于Gut（IF=23.059）上。

技術路線

結果：

1）FSTL1在纖維化肝組織的巨噬細胞中表達增加

首先，我們的目標是研究FSTL1在纖維化肝臟樣本中的表達特征。我們收集了51個人類肝臟樣本，包括正常和纖維化的肝臟組織。與正常對照肝臟相比，FSTL1的mRNA和蛋白表達在纖維化肝臟中顯著升高(圖1A,B)。接下來，我們確定FSTL1的表達是否主要在肝巨噬細胞中升高。雙免疫熒光染色顯示，FSTL1主要表達于人纖維化肝臟中的巨噬細胞上(圖1C)。通過重新分析一個已發布的數據集，我們發現FSTL1在HCV誘導或NASH誘導的肝纖維化中表達顯著升高(圖1D)。為了證實這些發現，我們在三種廣泛認可的肝纖維化動物模型中探索了FSTL1的表達，即CCl4注射誘導、BDL誘導和MCD飲食誘導的肝纖維化。所有模型肝組織中FSTL1的表達均顯著升高(圖1E,F)。然后，我們從纖維化的小鼠肝臟中分離出肝巨噬細胞。一致地，從纖維化肝臟分離的巨噬細胞中FSTL1 mRNA表達水平顯著升高(圖1G)。雙免疫熒光染色進一步顯示FSTL1+CD68+巨噬細胞在纖維化肝臟中明顯多于對照組(圖1H)。綜上所述，FSTL1在肝組織中表達顯著增加，尤其是在纖維化肝的巨噬細胞中。

2）髓系FSTL1缺乏可減輕肝纖維化

為了檢測FSTL1+巨噬細胞在肝纖維化中的功能，我們使用Cre-LoxP系統創建骨髓特異性FSTL1-deficient (FSTL1^M-KO)小鼠。然后用CCl4注射、BDL或MCD飲食誘導FSTL1^FL/FL和FSTL1^{M- KO}小鼠肝纖維化。圖2A顯示，Masson 's、Sirius Red和α-SMA染色顯示，FSTL1^M-KO小鼠的肝纖維化明顯低于FSTL1^FL/FL小鼠。此外，FSTL1^M-KO小鼠中血清丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶水平較低(圖2B)。此外，FSTL^{M- KO}小鼠肝臟組織中TGF-β、TIMP- 1和I型膠原蛋白的表達明顯低于同窩小鼠(圖2C)。WB分析進一步表明，FSTL1缺失降低了纖維化肝組織中I型膠原、α-SMA和TIMP- 1的表達(圖2 D)。我們的結果表明，髓系FSTL1缺乏可減輕小鼠的肝纖維化。

3）髓系FSTL1缺乏可減輕纖維化肝中的炎癥和巨噬細胞/中性粒細胞招募

我們研究了FSTL1⁺巨噬細胞對纖維化肝組織局部炎癥的影響。圖3A顯示FSTL1^M-KO小鼠的纖維化肝臟中TNF-α和IL-1β的表達低于對照組，IL-10的表達高于對照組。一致的是，FSTL1^M-KO小鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平較低，而IL-10高于同窩小鼠(圖3B)。此外，我們通過F4/80和CD11b(巨噬細胞標記物)和Ly6G(中性粒細胞標記物)染色評估纖維化肝組織中肝臟炎癥細胞的積累。與FSTL1^FL/FL小鼠相比，髓系特異性FSTL1缺乏顯著降低纖維化肝組織中的巨噬細胞和中性粒細胞浸潤(圖3C-E)。

4）髓系FSTL1缺乏可抑制纖維化肝臟中M1極化和NF-κB通路激活

如上所述，髓系特異性FSTL1缺失可減輕肝臟炎癥，提示FSTL1可能促進M1極化。首先，我們分析了肝臟切片中M1巨噬細胞的定量，結果顯示FSTL1^{M- KO}小鼠中觀察到的iNOS+CD68+巨噬細胞比FSTL1^FL/FL小鼠中要少(圖4A)。此外，在FSTL1^M-KO小鼠中，iNOS mRNA表達下調，而Arg1在纖維化肝臟中表達上調(圖4B)。WB分析顯示，與對照組相比，髓系FSTL1缺陷小鼠纖維化肝臟中iNOS和p-STAT1的表達減少，p-STAT6的表達增加(圖4C)。TLR-4/ NF-κB通路在巨噬細胞介導的急性/慢性肝臟炎癥中是一個特性良好的調控通路。在此，纖維化肝臟的免疫染色和WB分析也顯示FSTL1^{M- KO}小鼠表現出TLR- 4/NF-κB通路激活的抑制(圖4D,E)。

5）FSTL1直接與PKM2結合，增強PKM2在巨噬細胞中的穩定性

為了進一步研究巨噬細胞FSTL1在肝纖維化過程中的調節作用機制，我們采用免疫沉淀(IP)法和LC- MS/MS篩選法探索FSTL1與巨噬細胞中潛在蛋白的結合。我們特別感興趣的是確定PKM2是否與巨噬細胞中的FSTL1直接相互作用(圖5A,B)。結果顯示FSTL1在巨噬細胞中與PKM2結合(圖5C)。此外，共聚焦免疫熒光分析顯示，FSTL1與PKM2在細胞質和細胞核中共定位(圖5D)。接下來，我們分析了FSTL1- PKM2相互作用的關鍵域。根據之前報道的FSTL1和PKM2的結構特征，構建了編碼4個帶有HA標記的FSTL1截短片段和3個帶有FLAG標記的PKM2截短片段的質粒，轉染293 T細胞(圖5E)。我們的數據顯示FSTL1的FK結構域對PKM2的N-端或C-端相互作用至關重要(圖5F)。環己酰亞胺追蹤實驗的結果表明，在FSTL1下調的細胞中，PKM2的半衰期較短，而在FSTL1過表達的細胞中，PKM2的半衰期比對照細胞長得多(圖5G)。這些結果表明，FSTL1可能通過抑制蛋白酶體降解來調控PKM2的穩定性。值得注意的是，我們觀察到在FSTL1^M-KO和FSTL1^o/e骨髓源性巨噬細胞(BMDMs)培養物中加入MG-132后，PKM2蛋白水平降低并伴有FSTL1下調的情況得到了恢復(圖5H)。然后，利用體外泛素化實驗，我們檢測FSTL1是否參與泛素介導的PKM2降解。下調FSTL1可增加FSTL1^M-KO BMDMs中PKM2蛋白的泛素化水平。泛素介導的PKM2降解作用在FSTL1過表達的BMDMs中明顯消失(圖5I)。

6）FSTL1促進纖維化肝組織巨噬細胞中的PKM2磷酸化和核易位

為了探索PKM2在FSTL1介導的巨噬細胞促炎表型轉換中的作用，我們首先檢測了肝纖維化巨噬細胞中PKM2的表達是否發生改變。免疫熒光染色顯示，與對照組相比，纖維化肝臟中有更多的FSTL1+巨噬細胞和PKM2+巨噬細胞(圖6A)。然后，我們分析了PKM2和FSTL1在人肝臟標本細胞質和細胞核中的蛋白表達，顯示PKM2和FSTL1在纖維化肝組織胞質和細胞核中的表達均顯著增加(圖6B)，免疫熒光染色也顯示患者肝臟巨噬細胞中PKM2和FSTL1的核易位顯著增加(圖6A)。人類纖維化肝臟的結果與小鼠纖維化肝臟的結果相似。相反，與FSTL1^FL/FL小鼠相比，髓系FSTL1的破壞明顯減少了PKM2+巨噬細胞，并阻礙了PKM2在肝巨噬細胞中的核導入(圖6C)。圖6D顯示，與FSTL1^FL/FL對照相比，FSTL1缺失降低了細胞質中總PKM2和p-PKM2的表達，進而降低了細胞核中總PKM2的表達。總之，這些結果表明巨噬細胞FSTL1促進PKM2的核易位。

7）FSTL1缺失可減輕巨噬細胞的炎癥反應、M1極化和糖酵解

我們進一步分析FSTL1在體外對巨噬細胞功能的調節作用。FSTL1^M-KO巨噬細胞TNF-α和IL-1β表達降低，IL-10表達增加(圖7A,B)。與體內實驗一致，LPS處理后，FSTL1缺失減弱了M1極化，并降低了BMDMs中TLR-4/NF-κB通路的激活(圖7C-G)。接下來，我們探討了FSTL1缺乏是否能減少體外PKM2的表達和核易位。在FSTL1^M-KO BMDMs中，PKM2的表達及其核易位減弱(圖7C,D)。此外，我們發現，與FSTL1^FL/FL BMDMs相比，LPS刺激后FSTL1^{M- KO} BMDMs中的ECAR和乳酸顯著降低(圖7H,I)。我們使用糖酵解抑制劑 2-DG阻斷葡萄糖供應，發現FSTL1^M-KO BMDMs中IL-1β和iNOS表達的下降受到抑制(圖7J)。

8）PKM2激活物抑制FSTL1介導的巨噬細胞M1極化和糖酵解

為了進一步確定PKM2對FSTL1誘導的巨噬細胞極化和糖酵解的影響，用小分子PKM2激活劑DASA-58處理過表達FSTL1 (FSTL1^o/e)的BMDMs。DASA-58減輕FSTL1^o/e誘導的TNF-α和IL-1β，同時增加IL-10水平(圖8A,B)。PKM2、iNOS和p65的免疫熒光染色顯示，PKM2核易位抑制逆轉了FSTL1誘導的巨噬細胞M1極化和NF-κB活化(圖8C,D)。WB分析證實了BMDMs中PKM2、p- PKM2、iNOS、p-STAT1、p-STAT6、TLR-4、p-Ikk和p-p65的表達(圖8E-G)。為了進一步驗證PKM2在FSTL1介導的糖酵解中的作用，我們檢測了ECAR和相對乳酸釋放水平。FSTL1^o/e BMDMs中的ECAR和乳酸顯著高于FSTL1^n/e BMDMs，而DASA-58有效地逆轉了FSTL1^o/e誘導的糖酵解增加(圖8H,I)。此外，FSTL1^o/e相關的促炎介質(IL- 1β和iNOS)被2-DG中和(圖8J)。

結論：FSTL1通過與PKM2結合，促進PKM2磷酸化，抑制PKM2泛素化，從而促進M1極化、糖酵解和炎癥反應。我們的發現為改善巨噬細胞介導的肝臟炎癥和纖維化的新治療方法提供了理論基礎。

參考文獻：
Rao J, Wang H, Ni M, Wang Z, Wang Z, Wei S, Liu M, Wang P, Qiu J, Zhang L, Wu C, Shen H, Wang X, Cheng F, Lu L. FSTL1 promotes liver fibrosis by reprogramming macrophage function through modulating the intracellular function of PKM2. Gut. 2022 Feb 9:gutjnl-2021-325150. doi: 10.1136/gutjnl-2021-325150.