肝內膽管癌（ICC）是一種惡性腫瘤，由于ICC具有高度的侵襲性，且缺乏有效的治療手段，尤其是晚期患者，其預后極差。環狀RNA （circRNAs）是一類新型非編碼RNA ，異常表達的circRNA與癌癥的進展有關，而circRNAs在ICC癌的發生和發展中的作用仍有待確定。目前，有研究旨在鑒定ICC中上調的circRNA，并闡明其在信號通路中的功能。該研究發表在《Journal of Hepatology》，IF：25.083。

技術路線：

主要研究結果：

1. CircACTN4在ICC組織中上調

通過組織芯片發現，與癌旁組織相比，ICC組織中有17個CircRNA顯著上調（圖1A-B），且circACTN4表達量最高。qRT-PCR證實CircACTN4在ICC組織中過表達，以及對RNase R治療的耐藥性（圖1C, D）。qRT-PCR檢測circACTN4在四種細胞系中的表達，之后分別在RBE和FRH0201細胞系中探究了circACTN4的過表達和沉默（圖1E）。使用熒光原位雜交和亞細胞分離試驗，在RBE和FRH0201細胞的細胞核和細胞質中觀察到circACTN4轉錄本（圖1F,G）。與circACTN4低表達相比，ICC中circACTN4高表達與較差的3年總生存率和較高的復發率相關 （圖1H, I）。

圖1 CircACTN4的鑒定及其與ICC預后的關系

2. CircACTN4在體外和體內促進ICC細胞的增殖和侵襲

過表達circACTN4促進RBE細胞的增殖、遷移和侵襲，并且促進血管生成，而在FRH0201細胞中干擾circACTN4，抑制其惡性活動（圖2A-C）。在異種移植模型中，干擾circACTN4抑制肺轉移和腫瘤生長，而過表達circACTN4促進肺轉移和腫瘤生長（圖2D-G）。

圖2 CircACTN4在體外和體內促進ICC的增殖、遷移和侵襲

3. CircACTN4調控ICC細胞中FZD7的表達

RNA測序鑒定出過表達circACTN4的RBE細胞中有103個差異表達基因 （圖3A, B）。 qRT-PCR證實了Hippo/Wnt-related genes這些基因在過表達circACTN4的RBE細胞中過表達（圖3C, D）。Western blot顯示FZD7、ID2、CCN2和AXIN2的蛋白水平也隨著circACTN4過表達或敲低而改變（圖3E）。由于Wnt/b-catenin通路的受體FZD7在Hippo和Wnt通路中均高于ICC細胞中的circACTN4過度表達。TCGA數據庫揭示了FZD7在ICC組織中的表達水平明顯高于非腫瘤組織（圖3F）。這些結果通過組織樣本的qRT-PCR和IHC進一步證實（圖3G，H）。此外，在20個ICC組織中，circACTN4的表達與FZD7的表達呈正相關（圖3I）。ChIRP分析顯示circACTN4富集在FZD7啟動子轉錄起始位點（TSS）1200到800 bp的區域（圖3J）。同時circACTN4沉默后，H3K27Ac組蛋白活性修飾在同一位點的富集度降低，但circACTN4過度表達后增加（圖3K，L）。這些結果表明circACTN4可以結合FZD7啟動子并觸發FZD7表達。

圖3 CircACTN4上調ICC細胞中FZD7的表達

4. CircACTN4與YBX1相互作用

RNA-pull down和western blotting結果顯示，生物素標記的circACTN4探針可以在FRH0201細胞裂解液中沉淀內源性YBX1（圖4A），這進一步被RIP和RNA EMSA證實（圖4B, C）。這些結果表明，circACTN4和YBX1之間存在相互作用。circACTN4的表達與YBX1的表達呈正相關（圖4D）。此外，TCGA數據顯示，YBX1在ICC組織中的表達明顯高于非腫瘤組織（圖4E），這在ICC組織樣本中通過qRT-PCR和IHC驗證 （圖4F）。此外，circACTN4在RBE細胞中過表達和在FRH0201細胞中敲除均不影響YBX1 mRNA的表達（圖4G）。這些結果提示circACTN4與YBX1相互作用，并在ICC進展過程中啟動下游基因轉錄。

圖4 CircACTN4與YBX1相互作用

5. CircACTN4招募YBX1共同激活FZD7的轉錄

ChIP-seq分析表明，FRH0201細胞中的YBX1結合區廣泛分布于基因組中，其中24.88%是啟動子（圖5A，B）。YBX1結合區的基序分析顯示它們的結合序列偏好不同（圖5C）。通過重疊RNA-seq和ChIP-seq的結果，發現FZD7是ICC細胞中circACTN4和YBX1的靶點（圖5D）。ChIP-qPCR顯示，YBX1與FZD7啟動子富集在同一位點（-400bp~-1600bp）（圖5E）。此外，YBX1基因敲除抑制了H3K27Ac修飾在FRH0201細胞FZD7啟動子上的富集（圖5F）。為了進一步證實circACTN4和YBX1共同調控FZD7的轉錄，敲除circACTN4，發現FZD7啟動子上YBX1的富集程度減少（圖5G）。FZD7 mRNA和蛋白水平的變化也與YBX1過表達和敲低一致（圖5H）。細胞功能實驗表明，YBX1的恢復可以挽救FZD7敲低介導的FRH0201細胞生長、血管生成和轉移的抑制（圖5I-L）。這些結果提示circACTN4可能是YBX1介導的FZD7在ICC細胞中表達所必需的。

圖5 CircACTN4招募YBX1共激活FZD7轉錄

6. CircACTN4通過吸附miR- 424-5p上調YAP1的表達

Circular RNA Interactome數據庫預測，circACTN4可作為幾種miRNA的海綿。通過重疊Starbase和Circbase的miRNA靶標預測結果，12個候選miRNA被預測為circACTN4和YAP1的靶標（圖6A）。此外，在轉染si-circACTN4的FRH0201細胞中，只有miR-424-5p表達上調（圖6B），而在RNA-RIP實驗中，circACTN4可以直接與miR- 424-5p結合（圖6C）。轉染miR-424-5p mimic可導致RBE細胞增殖、遷移和侵襲能力下降（圖6D, E）。此外，在轉染miR-424-5p mimic的RBE細胞中，YAP1 mRNA和蛋白水平顯著降低，而miR-424-5p inhibitor的結果相反（圖6F）。這些結果表明，circACTN4通過海綿作用miR- 424-5p調節YAP1的表達。熒光素酶報告基因檢測顯示，與對照組相比，共轉染miR-424-5p mimic和野生型熒光素酶報告基因的HEK-293 T細胞的熒光素酶活性顯著降低（圖6G）。RIP實驗還顯示，與IgG組相比，argonaute 2組circACTN4和miR-424-5p的富集增加（圖6H）。這些結果提示circACTN4可作為miR-424- 5p的海綿在ICC細胞中上調YAP1。

圖6 CircACTN4通過海綿吸波miR-424-5p上調YAP1的表達

7. CircACTN4參與Wnt/Hippo信號通路

由于FZD7是Wnt信號通路受體，推測circACTN4可能通過促進FZD7轉錄參與了該通路的調控。B-catenin和p-GSK3b表達的變化與circACTN4過表達或敲低表達一致（圖7A）。在過表達circACTN4的RBE細胞中，b-catenin的核定位顯著增加，而在表達circACTN4的FRH0201細胞中，b-catenin的核定位降低（圖7B）。TOP/FOP - flash報告實驗顯示，Wnt/b-catenin通路活性分別根據circACTN4過表達或敲低而顯著增加或降低（圖7C）。免疫熒光檢測了circACTN4對b-catenin和YAP1蛋白細胞定位的影響（圖7D）。結果表明，YAP1和b-catenin共定位于circACTN4過表達的RBE細胞中，circACTN4促進了YAP1和b-catenin的核積累。免疫共沉淀進一步證實了YAP1與b-catenin之間的相互作用增強（圖7E）。這些結果表明，circACTN4增強了YAP1和b-catenin、Hippo和Wnt通路的相互作用，促進了它們在ICC中的激活。

圖7 CircACTN4參與Wnt/Hippo信號通路

結論：

ICC中circACTN4的高表達通過招募YBX1啟動FZD7轉錄促進腫瘤的發展和進展。此外，circACTN4作為miR-424-5p的分子海綿，上調YAP1的表達。此外，circACTN4在ICC腫瘤發生過程中充當Hippo/YAP和Wnt/b-catenin通路之間的交叉點。該研究有助于更好地理解ICC腫瘤的發生。

參考文獻：

Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription