結直腸癌（CRC）是世界上第三常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的主要原因。鐵死亡是最近發現的一種調節性細胞死亡。越來越多的證據表明，鐵死亡在癌癥的發生和發展中起著重要的調節作用。本研究確定TIGAR是CRC發展過程中抗鐵死亡的潛在調節因子。我們發現TIGAR在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織。TIGAR敲除顯著增加了erastin誘導的SW620和HCT116細胞鐵死亡。值得注意的是，TIGAR敲除顯著降低了GSH/GSSG比率，增加了脂質過氧化的產生，促進了脂質過氧化產物丙二醛（MDA）的積累，并使CRC細胞對erastin誘導的鐵死亡更加敏感。此外，TIGAR抑制以氧化還原和AMPK依賴的方式抑制SCD1的表達。因此，這些結果表明TIGAR通過ROS/AMPK/SCD1信號通路誘導結腸癌細胞的鐵死亡抗性。本文于2022年3月發表于“Free Radical Biology And Medicine”（IF= 7.376）上。

技術路線

結果

1）TIGAR在結腸癌中高表達

我們首先分析了TIGAR在不同細胞和非腫瘤組織中的表達模式。應用TNMplot分析TIGAR在不同腫瘤類型TCGA中的表達狀態。如圖1A所示，TIGAR在乳腺、結腸、肝臟、肺、胃、前列腺、皮膚、腎臟等腫瘤組織中的表達水平高于相應的鄰近正常組織。接下來，從TCGA數據庫中研究TIGAR在結腸癌組織中的表達。如圖1B所示，未配對和配對分析均表明，與相鄰正常組相比，結腸癌腫瘤組織中TIGAR mRNA表達上調，以及TCGA數據庫中各個癌癥階段的TIGAR mRNA表達上調。UALCAN的CPTAC數據集的結果顯示，結腸癌原發組織中TIGAR總蛋白的表達高于癌旁正常組織（圖1B）。此外，我們還檢測了一組結腸癌細胞中TIGAR的mRNA和蛋白。與正常結直腸細胞系NCM460相比，SW620、HCT116和DLD1細胞中TIGAR mRNA和蛋白質表達上調（圖1C和D）。總之，這些數據表明TIGAR在CRC的進展中起著關鍵作用。

2）鐵死亡與CRC的發展有關

我們研究了478例COAD患者TIGAR的生物學功能。基因集富集分析（GSEA）表明，許多與TIGAR相關的基因位于鐵死亡、氧化磷酸化和脂肪酸代謝中（NES>1.8, FDR<0.05）。（圖2A）。在這項研究中，我們分析了在結腸癌組織和正常鄰近組織中調節鐵死亡的關鍵基因的差異表達。結果表明，TCGA數據庫中22個基因在結腸癌組織和正常癌旁組織中的表達存在顯著差異。熱圖分析結果顯示，LPCAT3、ACO1、IREB2、NCOA4和HMOX1在結腸癌細胞中下調（圖2B）。而SLC3A2和GPX4在結腸癌細胞中上調（圖2B）。此外，我們在TCGA數據庫中使用UALCAN對鐵死亡的關鍵基因進行分類，并分析其在CRC組織和正常相鄰組織中的表達情況。結果顯示，與正常鄰近組織相比，CRC組織中SLC7A11、GPX4、ACSL4、TFRC和SLC11A2表達上調，而HMOX1、LPCAT3、ALOX12和SLC40A1表達下調(圖2C)。所有這些都表明，很多與鐵死亡相關的基因在結腸癌組織中異常表達。

3）鐵死亡誘導劑erastin對結腸癌細胞活力的影響

為了確定erastin在結腸癌細胞活力中的作用，我們首先在五種結腸癌細胞系DLD1、HT29、HCT116、SW480和SW620中測量了erastin對細胞活力的影響。我們發現erastin以劑量相關的方式抑制細胞增殖（圖3A）。為了進一步證實erastin對結腸癌細胞活力的影響，選擇2μM erastin處理不同的結腸癌細胞。HT29和SW480對2μM erastin處理的erastin誘導的鐵死亡高度敏感；DLD1、HCT116和SW620對經2μM erastin處理的鐵死亡具有抵抗力（圖3B）。由于SW620和HCT116細胞在所測試的CRC細胞系中具有最高水平的TIGAR，因此在以下實驗中選擇了HCT116和SW620細胞。這些數據表明TIGAR可能與HCT116和SW620細胞的鐵死亡抗性有關。

4）TIGAR敲除增強erastin誘導的SW620和HCT116細胞死亡

盡管TIGAR在氧化還原和代謝調節中起著重要作用，但對于TIGAR在結腸癌細胞中的抗鐵死亡性知之甚少。為了探討TIGAR對結腸癌細胞鐵死亡的影響，在HCT116和SW620細胞中用shRNA#1和#2敲除TIGAR。RT-qPCR和western blot證實，在HCT116和SW620細胞中，TIGAR的mRNA（圖4A）和蛋白質（圖4B）表達顯著下調。為了研究TIGAR在結腸癌細胞鐵死亡中的作用，用MTS法和細胞死亡法對HCT116和SW620細胞的細胞活力和細胞死亡進行了評估。HCT116和SW620細胞用鐵死亡誘導劑erastin和鐵死亡抑制劑ferrostatin-1處理24小時。如圖4C所示，TIGAR的敲除顯著增加了erastin誘導的生長抑制，這種效應可通過HCT116和SW620細胞中的ferrostatin-1逆轉。類似地，erastin治療增加了TIGAR敲除的HCT116和SW620細胞的細胞死亡，ferrostatin-1治療逆轉了TIGAR敲除的HCT116和SW620細胞的細胞死亡水平（圖4D）。這些結果表明，TIGAR敲除增加了HCT116和SW620細胞對鐵死亡的敏感性，TIGAR是鐵死亡的潛在負調節因子。

5）TIGAR敲除促進HCT116和SW620細胞的鐵死亡

脂質過氧化和鐵積累是鐵死亡的兩個主要生化特征。C11-BODIPY染色流式細胞術檢測脂質過氧化。如圖5A所示，shTIGAR#1和#2對TIGAR的敲除顯著降低了經erastin處理的HCT116和SW620細胞中的GSH/GSSG比率。此外，我們還進一步研究了TIGAR敲除對脂質過氧化和脂質過氧化終產物丙二醛（MDA）的影響。結果顯示，shTIGAR#1和#2對TIGAR的敲除顯著增加了HCT116和SW620細胞的脂質過氧化和MDA水平（圖5B和C）。有趣的是，在TIGAR敲除細胞中，鐵的相對水平沒有明顯變化（圖5D）。結果提示TIGAR敲除可誘導結腸癌細胞鐵死亡。

6）TIGAR敲除以ROS/AMPK依賴的方式抑制SCD1的表達

AMPK是細胞能量水平的關鍵傳感器，協調多種代謝途徑以維持能量平衡，包括脂質代謝。為了進一步確定TIGAR在脂質過氧化中的作用機制，我們研究了TIGAR對AMPK信號通路的影響。如圖6A所示，在HCT116和SW620細胞中，TIGAR的敲除顯著誘導AMPK的激活和SCD1表達的下調。為了了解AMPK信號通路的潛在作用，將AMPK抑制劑化合物C用于HCT116和SW620細胞。TIGAR敲除導致SCD1蛋白表達降低，而SCD1的蛋白表達隨著化合物C的處理而增加（圖6B）?；衔?/span>C的處理顯著增加了TIGAR敲除HCT116和SW620細胞的細胞活力（圖6C）。這些結果表明，敲除TIGAR可以以AMPK依賴的方式抑制SCD1的表達，從而促進鐵死亡。

7）TIGAR敲除以氧化還原依賴的方式抑制SCD1的表達

在以前的研究中，TIGAR顯示出強大的抗氧化作用，并顯著降低細胞內的ROS水平。用DCFH-DA和DHR123流式細胞術觀察活性氧。在erastin治療后，TIGAR敲除增加了ROS水平（圖7A）。為了進一步證明TIGAR通過活性氧影響鐵死亡，我們在HCT116和SW620細胞中添加了抗氧化劑NAC。在HCT116和SW620細胞中，TIGAR敲除導致SCD1的減少和p-AMPK蛋白表達的增加，而NAC處理使SCD1的蛋白表達增加，p-AMPK的蛋白表達降低（圖7B）。NAC治療顯著降低了TIGAR敲除的HCT116和SW620細胞的細胞死亡（圖7C）。這些結果表明TIGAR通過ROS/AMPK調節增強了結腸癌細胞對鐵死亡的抵抗力。

結論：我們的工作揭示了TIGAR抑制結腸癌細胞鐵死亡的調節機制。結腸癌細胞中TIGAR的缺失通過增加ROS產生和促進ROS/AMPK介導的SCD1下調表達促進脂質過氧化。因此，靶向TIGAR可能是一種潛在的基于鐵死亡的結腸癌的治療方法。

參考文獻：

Liu MY, Li HM, Wang XY, Xia R, Li X, Ma YJ, Wang M, Zhang HS. TIGAR drives colorectal cancer ferroptosis resistance through ROS/AMPK/SCD1 pathway. Free Radic Biol Med. 2022 Mar 7;182:219-231. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2022.03.002.