谷氨酰胺酶(GLS)同工酶GLS1和GLS2催化谷氨酰胺分解的第一步。GLS1是Th17分化的必要條件，其抑制作用可抑制動物自身免疫性疾病，但GLS2的功能尚不清楚。本研究旨在探討GLS2在CD4+ T細胞功能和系統性紅斑狼瘡(SLE)發病機制中的作用。本研究結果表明，GLS2通過支持抗氧化防御，在CD4+ T細胞產生IL-2中發揮關鍵作用，并提供了一種新的方法來糾正SLE中T細胞產生IL-2。本研究于2022年3月發表在《Arthritis Rheumatology》IF:10.995期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、在CD4+ T細胞中GLS2通過表觀遺傳降低ROS水平并增加IL-2的產生

GLS2在多種癌癥細胞系中被報道可降低ROS水平。為了評估GLS2是否降低CD4+T細胞中ROS水平，對na?ve CD4+ T細胞加以CD3和CD28抗體刺激，并轉染空白載體、GLS1和GLS2過表達載體。結果如圖1A所示，過表達GLS2而不是GLS1可以顯著降低細胞內ROS水平。高水平ROS會早知脂質過氧化最終導致線粒體紊亂。和預期一致，GLS2過表達減少了CD4+T細胞的脂質過氧化（圖1B）。Mitotracker Deep red和Green staining組合染色結果顯示CD4+T細胞中GLS2過表達降低了線粒體去極化的細胞組分（圖1C）。

此前，有研究表明使用NAC處理，一種ROS清除劑和GSH前體，可顯著減少T細胞中ROS水平并增加IL-2的產生，用其治療SLE患者可抑制疾病相關指標。本研究發現，過表達GLS2而非GLS1顯著增加了CD4+T細胞IL-2啟動子的活性和細胞上清中IL-2的濃度（圖1D-1E）。由于IL-2表達是由IL-2基因啟動子的CpG-DNA甲基化控制，所以作者進一步評估了IL-2基因啟動子的CpG-DNA甲基化。基于此前報道和序列的保守性，作者關注4個甲基化區域（圖1F）。過表達GLS2而非GLS1，導致CpG-DNA甲基化位點CNS1，CNS2，CNS3而非CNS4顯著下降（圖1G）。

總之，這些結果證實過表達GLS2而不是GLS1，顯著降低CD4+T細胞的ROS水平，脂質過氧化和線粒體異常，并增加IL-2的產生。

圖1在CD4+ T細胞中GLS2降低ROS水平并增加IL-2的產生

2、PDZ 結構域結合基序是 GLS2 介導的 ROS 和 IL-2 調節的必要條件

為理解GLS2和GLS1的差別是如何存在的，作者關注于兩種蛋白質的結構。GLS2和GLS1的主要氨基酸序列排列都比較相近，而最大的差別在于它們的C端和N端。與GLS1不同，GLS2的C端有一個PDZ結構域結合基序，它可以與含有PDZ結構域的蛋白質結合（圖2A）。據此，作者推測，GLS2對IL-2和ROS的調控依賴于蛋白質-蛋白質相互作用通過PDZ結構域。為了這個目的，作者構建了GLS2過表達載體，但其中PDZ結構域結合基序被相應的GLS1序列取代（圖2A）。有趣的是，突變PDZ結構域結合基序后導致GLS2對ROS水平、脂質過氧化、線粒體異常的降低作用和對IL-2啟動子活性的回復作用均顯著減弱（圖2B-2E）。總之，這些結果表明PDZ 結構域結合基序是 GLS2 介導的 ROS 和 IL-2 調節的必要條件。

圖2GLS2介導的IL-2和ROS調控需要PDZ結合結構域

3、GLS2 可降低來自狼瘡易發小鼠和 SLE 患者的 CD4+ T 細胞的ROS 水平并恢復產生 IL-2

CD4+ T 細胞中 IL-2 產生不足和細胞質 ROS 水平升高是 SLE 發展的關鍵因素。如圖3A和3B所示，與對照鼠和健康人中分理出的CD4+ T 細胞比較，SLE模型鼠和SLE患者中分離出的CD4+ T 細胞中GLS2蛋白表達水平顯著下降。此外，有無CD3和CD28抗體刺激的小鼠和人CD4+ T細胞中GLS2的表達差異無統計學意義，表明GLS2在狼瘡T細胞中下降不是由于激活T細胞的增加。接下來，作者轉染GLS1和GLS2過表達載體至SLE模型鼠和SLE患者分離出的CD4+T細胞中。結果顯示，過表達GLS2而非GLS1，顯著降低CD4+T細胞ROS水平，并回復IL-2啟動子活性（圖3C-3F）。這些結果說明GLS2糾正SLE來源CD4+T細胞的ROS的異常并回復IL2產生至正常水平。

圖3 GLS2恢復CD4+ T細胞中IL-2的產生并降低的ROS水平，這些細胞來自有紅斑狼瘡傾向的小鼠和SLE患者

參考文獻：

Hisada Ryo., Yoshida Nobuya., Orite Seo Yeon K., Umeda Masataka., Burbano Catalina., Scherlinger Marc., Kono Michihito., Krishfield Suzanne., Tsokos George C.(2022). Glutaminase 2 Promotes Interleukin-2 Production in CD4 T cells by Supporting Antioxidant Defense. Arthritis Rheumatol, undefined(undefined), undefined. doi:10.1002/art.42112