近年來的研究表明，微生物與宿主的相互作用在結腸直腸癌(Colorectal cancer，CRC)中發揮重要作用。隨著宏基因組測序技術的發展，發現了多種參與CRC致癌的微生物群，其中具核梭桿菌（Fusbacterium nucleatum，Fn）能通過調控機體免疫應答、表觀遺傳及宿主代謝等多個方面促進結直腸癌的發生發展，然而其潛在的機制仍不清楚。本研究中作者探索在CRC發生發展中的調控機制。本研究于2022年3月發表于《Nature Communications》，IF=14.919。

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1 具核梭桿菌減少了人CRC細胞和移植模型組織中METTL3介導的m6A修飾

斑點雜交分析顯示，與對照組和大腸桿菌共培養的細胞相比，與具核梭桿菌共培養的細胞中m6A水平顯著降低(Fig 1a)。在另一種CRC細胞LoVo中也觀察到具核梭桿菌對m6A修飾的下調。有趣的是，具核梭桿菌短期處理能夠誘導mRNA m6A修飾的減少(Fig 1b)。通過超高效液相色譜-四極萃取質譜分析也證實了經具核梭桿菌細胞處理后，m6A在總mRNA中的顯著下降 (Fig 1c)。此外具核梭桿菌處理顯著促進了細胞遷移 (Fig 1d）。

已經研究證明，m6A寫入器和擦除器參與了m6A修飾的動態穩態。Western blot結果顯示，在HCT116和LoVoF細胞中，具核梭桿菌處理明顯降低了HCT116細胞中 m6A甲基化酶METTL3的表達(Fig 1e)。而具核梭桿菌處理對其他m6A橡皮或讀寫器的表達無明顯影響(Fig 1e），提示m6A修飾的減少可能是由具核梭桿菌下調METTL3所致。

作者建立了CRC移植模型模型PDX (Fig 1f)。發現具核梭桿菌處理的PDX腫瘤組織體外核體m6A整體水平明顯下降(Fig 1g)。與大腸桿菌處理或PBS對照相比，具核梭桿菌處理的PDX組織中METTL3 mRNA水平也顯著降低(Fig 1h)。

野生型METTL3的異位表達挽救了具核梭桿菌引起的m6A水平下降，而非其催化突變體(Fig 1i)。此外，作者試圖確定METTL3介導了m6A修飾是否參與了具核梭桿菌處理誘導的CRC細胞遷移增強。Transwell檢測表明，過表達野生型METTL3，而非其催化突變體，明顯逆轉了具核梭桿菌處理增強的HCT116細胞侵襲能力（Fig 1J）。綜上所述，具核梭桿菌通過下調人結直腸癌細胞和PDX組織中METTL3 介導的m6A修飾水平，從而促進結直腸癌細胞的侵襲。

Fig1  具核梭桿菌可減少人CRC細胞和PDX組織中METTL3介導的m6A修飾

2 具核梭桿菌通過調節Hippo-YAP信號通路抑制METTL3

NF-κB和hippoyap信號通路相關基因在HCT116和LoVo細胞中都被激活(Fig 2a，b)。作者分離的細胞質和核成分HCT116細胞，發現具核梭桿菌增加了YAP在細胞核中的比例(Fig 2C)。免疫熒光檢測結果也證實了YAP顯著升高，Transwell實驗表明，YAP基因的敲除可顯著逆轉具核梭桿菌誘導的HCT116細胞和 LoVo細胞遷移能力的增強(Fig 2g)。于是作者提出YAP是否調控METTL3的表達。當YAP被兩種不同的siRNA沉默時，METTL3蛋白水平和m6A水平顯著升高(Fig 2 h,i)。相反，YAP異位表達下調METTL3和m6A水平，提示YAP信號通路可能是CRC細胞中METTL3的負向上游調節因子(Fig 2j,k)。此外，過表達METTL3可以抑制YAP異位表達引起的細胞遷移(Fig 2l)。作者還驗證了在具核梭桿菌存在下，YAP在調控基因表達中的作用對METTL3的調控作用。結果表明，具核梭桿菌處理降低了METTL3的表達，而YAP卻幾乎完全挽救了下調(Fig 2m)，提示在CRC細胞中，YAP信號通路參與了具核梭桿菌誘導的METTL3表達下調。

Fig2具核梭桿菌通過調節hippo-YAP信號通路抑制METTL3

3  FOXD3是METTL3的轉錄因子

Venn圖顯示在METTL3的啟動子區域有很多FOXD3的結合位點(?1778 -?1957 bp)，暗示FOXD3可能是METTL3的轉錄因子(Fig 3a)。

FOXD3的異位表達顯著增加的METTL3蛋白水平(Fig 3b)。FOXD3的敲低顯著的降低了METTL3蛋白的表達(Fig 3c)。此外，FOXD3過表達增加了m6A水平(Fig 3d)，翹除FOXD3降低了m6A水平(Fig 3e)，這表明FOXD3是METTL3的正向調節因子。為了驗證FOXD3是否是METTL3的直接轉錄因子，采用染色質免疫沉淀(ChIP)檢測，結果表明FOXD3與METTL3啟動子結合(Fig 3f)。 此外，雙熒光素酶報告基因實驗證實FOXD3的過表達顯著增強了HCT116細胞中METTL3-熒光素酶活性(Fig 3g)。提示FOXD3是METTL3的一種正轉錄因子。

有趣的是，ChIP實驗顯示具核梭桿菌處理顯著降低了FOXD3與METTL3啟動子區域的相互作用，這表明具核梭桿菌處理抑制了FOXD3介導的METTL3的轉錄(Fig 3h)。雙熒光素酶報告基因檢測證實，具核梭桿菌處理確實降低了FOXD3刺激METTL3的轉錄活性(Fig 3i)。作者進一步發現，具核梭桿菌處理顯著降低了PDX組織中的FOXD3水平(Fig 3j)。具核梭桿菌處理的HCT116和LoVo細胞也得到相似的結果(Fig 3k）。接下來，作者在HCT116細胞中敲低YAP，發現FOXD3升高(Fig 3l)。Western blot檢測證實，YAP的缺失增加了FOXD3的表達(Fig 3m)。總的來說，作者的工作揭示了FOXD3是METTL3的轉錄因子。具核梭桿菌可能通過YAP/ FOXD3軸下調METTL3的表達。

Fig 3 FOXD3是METTL3的轉錄因子

4具核梭桿菌處理后，結直腸癌細胞中m6a調控基因發生變異

為了研究特定基因中m6A修飾的變化，作者在具核梭桿菌處理的HCT116細胞中進行了全轉錄組的m6A測序，m6A測序分析發現，與未處理的細胞相比，經具核梭桿菌處理的HCT116細胞中發生了5841個m6A峰的變化，包括2835個m6A- up峰和3006個m6A- down峰。一個特殊的WGGAM motif (W = A/T， M= A/C)在未處理組的m6A位點中高度富集，而AVWGGA (V = C/G/A， W= A/T)基序只存在于具核梭桿菌處理的細胞中(Fig 4a)。此外，作者還觀察到m6A峰在起始密碼子和終止密碼子附近特別豐富。具核梭桿菌處理的細胞中m6A峰明顯下降(Fig 4b)。基于m6A-seq結果，作者進一步分析了總的m6A mRNA分布模式。作者觀察到具核梭桿菌處理后細胞中mRNA的5'UTR附近的m6A峰和CDS區減少，但3'UTR區保持了類似的豐度(Fig 4c)。

在具核梭桿菌處理的細胞中共鑒定出3589個基因，m6A水平有顯著差異。其中1585個基因m6A表達上調，2004個基因m6A表達下調。基于這些差異基因，KEGG通路富集分析顯示，具核梭桿菌影響CRC細胞的多個方面，包括局灶性黏著、緊密連接和Hippo信號通路。在具核梭桿菌處理的細胞中共鑒定出3589個基因，其中1585個基因m6A表達上調，2004個基因m6A表達下調。此外，基因本體論(GO)富集分析顯示，在具核梭桿菌處理的CRC細胞中，少數與GTPase活性調節、細胞骨架組織和細胞極性重塑相關的基因發生了m6A修飾((Fig 4e)。

Fig4具核梭桿菌處理后，結直腸癌細胞中m6a調控基因發生變異

 5 m6A-seq和RNA-seq顯示KIF26B是和METTL3的下游靶點

為了確定具核梭桿菌刺激m6a調控的CRC侵襲性的潛在下游靶點，作者對具核梭桿菌處理的HCT116細胞進行了mRNA測序。表達譜分析發現155個基因上調，88個基因下調基因(Fig 5a)。作者發現在2004個m6a下調基因和155個mRNA上調基因之間有5個基因重疊(Fig 5b)。在鑒定的5個基因中，驅動蛋白家族成員26B (KIF26B)參與細胞骨架重組，氧化石墨烯分析表明，細胞骨架重組，對CRC侵襲性至關重要(Fig 4e)。m6A測序顯示，具核梭桿菌處理后的kif26b mRNA中終止密碼子附近的m6A峰值顯著下降(Fig 5c)。m6A qpcr檢測結果表明，m6A的富集經具核梭桿菌處理后，KIF26B mRNA確實減少(Fig 5d)。同時，作者的數據證實了具核梭桿菌處理的HCT116和LoVo細胞中KIF26B的mRNA和蛋白水平均顯著升高(圖5e， f)。因此，作者選擇KIF26B作為METTL3介導的m6A修飾在CRC細胞中的候選靶點。

為了驗證KIF26B mRNA是METTL3的靶點，作者進行了RNA免疫沉淀(RIP)，以METTL3靶基因CREBBP為陽性對照，HPRT1為陰性對照。結果顯示，KIF26B mRNA與METTL3之間存在明顯的相互作用，表明KIF26B mRNA作為METTL3的直接靶點(Fig 5g)。敲除METTL3可顯著增加表達KIF26B在HCT116和LoVo細胞中的表達(Fig 5h，i)。這些數據表明KIF26B的表達受YAP/FOXD3/METTL3軸的調控。此外，具核梭桿菌誘導的KIF26B的上調被野生型METTL3的異位表達所逆轉，而不是其催化突變體，這表明具核梭桿菌的KIF26B的上調被野生型METTL3的異位表達所逆轉，具核梭桿菌對KIF26B的上調依賴于METTL3的m6A甲基轉移酶活性(Fig 5j)。

為了進一步證實m6A修飾有助于調控KIF26B的表達，作者用甲基化抑制劑DAA處理HCT116細胞。發現DAA處理誘導明顯增加KIF26B mRNA和蛋白表達 (Fig 5k, l)。具核梭桿菌處理誘導KIF26B mRNA和蛋白通過METTL3介導的m6A修飾上調KIF26B表達。qRT-PCR結果顯示，具核梭桿菌顯著延長了HCT116和LoVo細胞中KIF26B mRNA的半衰期(Fig 5m)。以往的研究報道，YTHDF2特異性識別m6a修飾的mRNA，調節其穩定性。基于此，作者進行了RIP實驗并發現YTHDF2與KIF26B mRNA結合(Fig 5n)。YTHDF2誘導KIF26B mRNA顯著升高(Fig 5o)。

綜上所述，這些結果表明具核梭桿菌誘導的METTL3下調降低KIF26B的m6A修飾水平，進一步減少YTHDF2依賴的mRNA降解，從而促進KIF26B在CRC細胞中的表達。

Fig 5  KIF26B是和METTL3的下游靶點

6具核梭桿菌通過上調KIF26B促進CRC侵襲和轉移

最近的研究報道，KIF26B作為一種癌基因參與胃癌和乳腺癌的發病。然而，KIF26B在CRC侵襲性和轉移中的潛在作用尚未被研究。作者敲除了HCT116細胞中的KIF26B，并進行了mRNA測序(Fig 6a)。轉錄組分析揭示KIF26B與細胞-細胞連接和對生長因子刺激的反應有關(Fig 6b)， 這對CRC細胞的侵襲性很重要。Go和KEGG通路富集分析表明，Hippo信號通路在kif26b調控的基因簽名中顯著富集(Fig 6C)。此外， 具核梭桿菌可顯促進細胞遷移，而KIF26B的下調則可明顯降低具核梭桿菌誘導的細胞遷移能力(Fig 6d,e )。此外，METTL3敲低的 HCT116細胞中沉默KIF26B，發現KIF26B的缺失顯著逆轉了METTL3敲除引起的細胞遷移增強(Fig 6g)， 提示KIF26B，至少部分地，介導了METTL3在CRC侵襲性中的功能。

在另外兩種CRC細胞，RKO和SW620細胞中進一步驗證KIF26B在CRC轉移中的重要作用。HE染色觀察到，注射CRC細胞的小鼠肝臟出現嚴重的轉移性結節(Fig 6h)。KIF26B基因的下調顯著減少了肝轉移(Fig 6h，i)。與大腸桿菌處理過的對照細胞相比，注射具核梭桿菌細胞的小鼠形成了明顯的肝轉移結節，KIF26B基因敲低顯著降低具核梭桿菌誘導的肝轉移(Fig 6j,k)。

Fig6具核梭桿菌通過上調KIF26B促進CRC侵襲和轉移

7具核梭桿菌與CRC患者METTL3和KIF26B的表達相關

為了在結腸直腸中建立高具核梭桿菌環境，C57BL/6小鼠在接受抗生素鏈霉素治療3天后，每天進行具核梭桿菌或大腸桿菌處理(Fig 7a)。治療15天后，作者觀察到小鼠結腸直腸中有具核梭桿菌富集(Fig 7b)。值得注意的是，qRT-PCR分析顯示，與大腸桿菌組相比經具核梭桿菌處理的小鼠結腸組織中METTL3 mRNA顯著下降，KIF26B mRNA表達增加(Fig 7c,d)。

為探討核仁具核梭桿菌/METTL3/KIF26B在晚期CRC患者中的臨床意義，進行了CRC樣本收集。作者的研究結果表明，具核梭桿菌在腫瘤組織中的豐度顯著高于匹配的非腫瘤組織(Fig 7e)。有趣的是，METTL3在腫瘤組織中的表達水平被下調(Fig 7f)，而KIF26B在腫瘤組織中的表達水平顯著高于匹配的非腫瘤組織(Fig 7g)。在CRC腫瘤組織中，核仁芽孢桿菌(具核梭桿菌)的豐度與METTL3的含量呈負相關(Fig 7h)。在CRC腫瘤組織中，METTL3和KIF26B的表達水平呈負相關(Fig 7i)。此外，作者還分析了KIF26B表達對患者預后的影響。Cancer Genome Atlas (TCGA)數據庫的Kaplan-Meier分析顯示，KIF26B高表達與CRC患者較短的總生存時間顯著相關(Fig 7j)。多因素Cox分析證實KIF26B高表達與CRC患者不良預后獨立相關(Fig 7k)。

本研究為腸道菌群對人m6A轉錄組的影響及其在促進CRC轉移中的作用提供了關鍵的見解。具核梭桿菌通過YAP/FOXD3/METTL3軸誘導m6A修飾的減少，導致KIF26B上調，增強CRC細胞的侵襲性。提供了一種潛在的一種潛在的靶向具核梭桿菌或KIF26B的治療策略。

參考文獻：
Chen, S., et al., Fusobacterium nucleatum reduces METTL3-mediated m(6)A modification and contributes to colorectal cancer metastasis. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 1248.