miRNA調節基因表達，參與腫瘤的發生和發展。因此，識別與miRNA和治療靶點相關的惡性表型將有助于改善鼻咽癌（NPC）的治療。在這項研究中，我們證明let-7i-5p的過表達通過靶向NPC中的ATG10和ATG16L1從而促進惡性表型。根據對GEO和TCGA數據庫的分析，let-7i-5p在鼻咽癌和頭頸癌中的表達水平顯著升高。通過對150例鼻咽癌組織的隊列研究，我們發現let-7i-5p與晚期、復發、轉移、淋巴結轉移和不良臨床結果相關。除了一系列體外細胞分析外，體內小鼠腫瘤模型顯示let-7i-5p通過靶向ATG10和ATG16L1抑制自噬并促進NPC的惡性表型。我們的研究結果表明，let-7i-5p可能是鼻咽癌治療的一個有希望的治療靶點。本文于2022年1月發表于“Cancer Letters”（IF= 8.679）上。

技術路線

結果

1）Let-7i-5p在鼻咽癌組織中的表達水平升高，并與不良臨床結果相關

為了評估NPC miRNA表達譜，使用GEO數據庫（GSE70970）對246個腫瘤組織和17個非腫瘤組織的微陣列數據集進行分析。這些數據顯示，33個miRNA的表達發生了顯著改變。排名前1-17位的候選基因是EBV相關的miRNA，第18位是let-7i-5p，它在NPC組織中顯著增加，引起了我們的注意（圖1A）。TCGA數據庫查詢用于確認let-7i-5p在頭頸癌中的表達增加（圖1B和C）。為了評估let-7i-5p在鼻咽癌中的作用，我們使用鼻咽癌組織芯片進行了原位雜交并進行了分析。結果顯示，let-7i-5p在終末期疾病患者中顯著上調，包括臨床IV期、復發、遠處轉移和淋巴結轉移（圖1D-G）。Kaplan–Meier分析顯示，let-7i-5p高表達患者的總生存率（OS）和無進展生存率（DFS）低于let-7i-5p低表達患者（圖1H和I）。這些結果表明let-7i-5p的過表達在NPC進展中作為癌基因發揮作用，并代表一個有價值的預后生物標志物。

2）Let-7i-5p在體外促進鼻咽癌的遷移和增殖

通過一系列細胞分析進一步探討了let-7i-5p在鼻咽癌中的致癌作用。首先，使用qRT–PCR測定NPC細胞系和非癌鼻咽上皮細胞系NP69中的let-7i-5p水平。let-7i-5p在所有NPC細胞系中顯著過表達（圖2A）。因為CNE-2和5-8F細胞系的表達量最高，所以它們被用來研究let-7i-5p對鼻咽癌細胞的直接影響。在用let-7i-5p抑制劑轉染后，測定干擾效率以確認生成具有低let-7i-5p表達的細胞（圖2B和C）。然后使用傷口愈合試驗、Transwell試驗、菌落形成試驗、EdU試驗和流式細胞術來確定let-7i-5p對NPC細胞生長和遷移的影響。根據傷口愈合和Transwell分析，let-7i-5p下調抑制了細胞遷移（圖2D-G）。此外，基于增殖特性實驗，包括集落分析、EdU和流式細胞術，let-7i-5p敲除抑制NPC細胞的增殖能力（圖2H-M）。這些發現表明let-7i-5p在體外調節鼻咽癌細胞的遷移和增殖。

3）干擾let-7i-5p表達抑制體內鼻咽癌的轉移和增殖能力

為了確定let-7i-5p是否在體內促進鼻咽癌轉移和生長，我們建立了小鼠腫瘤異種移植和腫瘤轉移模型。在敲除let-7i-5p后，將細胞接種到裸鼠腋窩，以評估let-7i-5p對細胞生長的影響（圖3A）。移植后21天，切除異種移植腫瘤并稱重。let-7i-5p低表達的細胞增殖減少（圖3B和C）。此后，我們使用小鼠腫瘤轉移模型來評估NPC轉移。通過尾靜脈將具有let-7i-5p抑制或對照的細胞注射到裸鼠體內。在實驗期間，通過每3天測量一次生物發光來監測轉移。注射后45天，NC組的三只裸鼠出現肺轉移，而let-7i-5p基因敲除組的小鼠沒有出現轉移（圖3D和E）。肺組織的HE染色顯示，let-7i-5p低表達的小鼠表現出減少的癌癥病變（圖3F）。綜上所述，這些數據表明let-7i-5p可加速鼻咽癌的轉移和生長。

4）Let-7i-5p抑制鼻咽癌細胞自噬活性

由于一些自噬相關的miRNA已被報道可加速惡性表型，我們研究了let-7i-5p是否調節NPC自噬活性。我們發現沉默let-7i-5p表達導致LC3聚集的顯著誘導，表明自噬體形成增加（圖4A-D）。然后使用串聯單體mRFP-GFP標記的LC3來確定let-7i-5p在自噬通量中的作用。如圖4E-F所示，let-7i-5p基因敲除后，黃色熒光自噬體和紅色熒光自溶體的數量顯著增加（圖4E-F）。與單獨使用氯喹（CQ）治療相比，CQ和let-7i-5p敲除聯合治療導致黃色熒光自噬體進一步累積（圖4E-F）。這些結果表明let-7i-5p能有效抑制鼻咽癌細胞自噬體的形成和自噬通量。此外，通過免疫印跡檢測自噬標記物LC3-I、LC3-II、自噬底物p62和自噬相關基因ATG5。我們觀察到，隨著let-7i-5p基因敲除，ATG5和LC3-II表達增加，p62水平降低（圖4G-J）。總的來說，這些結果表明let-7i-5p能有效抑制鼻咽癌細胞的自噬活性。

5）ATG10和ATG16L1是let-7i-5p的直接靶點

最近的研究表明，miRNA可以通過靶向自噬相關基因來調節自噬，從而影響惡性轉化。因此，我們探索了let-7i-5p是否也通過靶向自噬相關基因來調節鼻咽癌細胞的自噬水平。使用生物信息學工具和兩個miRNA數據庫，740個基因被確定為let-7i-5p的潛在靶點（圖5A）。為了進一步確定let-7i-5p調節自噬的靶基因，我們在對740個預測候選基因進行KEGG通路分析后，重點研究了自噬相關通路（圖5B）。在12個自噬相關靶點中，自噬相關基因10（ATG10）和自噬相關基因16 L（ATG16L）因其在調節自噬中的直接作用而被選中。通過將目標基因（WT-3′UTR）的3′UTR或突變序列（mut-3′UTR）克隆到熒光素酶質粒中，使用熒光素酶報告基因分析驗證了let-7i-5p與ATG10和ATG16L的3’-UTR之間的生物有效相互作用（圖5C）。let-7i-5p、ATG10和ATG16L的潛在結合位點如圖5D所示。此外，在let-7i-5p缺失的鼻咽癌細胞和異種移植瘤中，ATG10和ATG16L1表達水平顯著升高(圖5E-H)。在缺乏let-7i-5p的細胞中，ATG12（ATG12-ATG5-ATG16復合物的一部分）的表達增加，而在ATG8中未觀察到明顯變化（圖5E-F）。由LC3表達確定的自噬活性證實了let-7i-5p對自噬的影響（圖5G-H）。這些數據清楚地表明ATG10和ATG16L是let-7i-5p的直接目標。

6）ATG10和ATG16L1對于let-7i-5p促進惡性NPC表型至關重要

為了研究ATG10和ATG16L1是否逆轉let-7i-5p誘導的NPC惡性表型，我們進行了體外和體內拯救實驗。ATG10和/或ATG16L1的敲除消除了let-7i-5p抑制增加細胞遷移和增殖的能力（圖6A-C）。此外，小鼠異種移植瘤實驗結果顯示，let-7i-5p抑制降低了鼻咽癌細胞的增殖；然而，這種效應在ATG10和ATG16L1抑制后降低（圖6D-E），表明let-7i-5p促進惡性表型取決于其抑制ATG10和ATG16L1表達的能力（圖6F-G）。這些結果表明let-7i-5p的促腫瘤作用需要自噬相關基因ATG10和ATG16L1。

結論：我們的研究揭示了let-7i-5p通過靶向ATG10和ATG16L1抑制自噬來促進惡性表型的機制。我們的數據表明，let-7i-5p水平在鼻咽癌晚期顯著升高，有助于預測臨床結果。我們的研究為基于let-7i-5p的鼻咽癌分子治療策略的制定提供了潛在的臨床應用和新的方向。

參考文獻：

You B, Zhang P, Gu M, Yin H, Fan Y, Yao H, Pan S, Xie H, Cheng T, Liu H, You Y, Liu J. Let-7i-5p promotes a malignant phenotype in nasopharyngeal carcinoma via inhibiting tumor-suppressive autophagy. Cancer Lett. 2022 Jan 29;531:14-26. doi: 10.1016/j.canlet.2022.01.019.