從人類心臟活組織中產生的心球衍生細胞（CDCs）在臨床試驗中已被證明具有疾病修飾的生物活性。矛盾的是，CDCs在心臟的細胞起源仍然難以捉摸。本研究使用單細胞RNA測序(sc-RNAseq)研究了CDCs與心臟非肌細胞和非造血細胞(心臟成纖維細胞/CFs、平滑肌細胞/SMCs和內皮細胞/ECs)的分子特性。總之，CDCs是一種富含線粒體的細胞，具有獨特的特性，但也與右心房CFs相似。CDCs表現出高度增殖、分泌和免疫調節的特性，這些特性也可在活化或炎癥細胞類型中發現。通過特殊的培養條件，CDCs獲得一些生物活性，包括血管生成潛力，這可以改變某些疾病的異常。 本研究于2022年3月發表在《Basic Research in Cardiology》IF：17.165雜志上。

技術路線如下：

主要實驗結果如下：

1、成人CDCs的特征與其他原發性非肌細胞類型相比

CDCs分離自接受心臟手術的成人右心耳組織，并通過包括生長因子刺激在內的“3D心球”建立的(Fig. 1A)。為了評估CDCs不同的分子譜，將其與心臟成纖維細胞(CFs)、平滑肌細胞(SMCs)、內皮細胞(ECs)和脂肪組織來源成纖維細胞(AFs)等非心臟細胞類型進行比較。分別從心臟脂肪組織和皮下脂肪組織中分離出CFs和AFs(Fig. 1A)。冠狀動脈搭橋術(CABG)患者的胸廓血管生成ECs和SMCs(Fig. 1A)。

首先qRT-PCR檢測了這些細胞類型的表面標志物以驗證是否分離正確（Fig. 1B–F）。隨后免疫細胞化學染色或流式細胞術進一步評價選定標志物的蛋白水平(Fig. 1G–L)。總之，這些結果表明CDCs表現出與非肌細胞類型相似的分子特征。然而，CDCs明顯不同于真正的心臟祖細胞(DIFF D6)和未成熟的心肌細胞(DIFF D8)。描述良好的CDCs標記物，如CD105，在AFs、CF、SMCs和ECs中均有表達。

圖1與其他原發性非肌細胞類型相比，成人CDC的特征

2、CDCs的單細胞RNA測序與主要的心臟非肌細胞類型進行比較

對CDCs細胞，和3中主要的心臟非肌細胞CF、SMCs和ECs進行單細胞測序。圖2A根據細胞標識描述了細胞類型。對于CDCs，CF、SMCs和ECs，鑒定了上調的前10個基因(Fig. 2B)。CFs、SMCs、ECs和CDCs的無監督全局聚類根據其特定的基因表達將其細分為11個不同的聚類，從視覺上看，所有細胞類型都分裂成兩個主要的簇，有時還會有進一步的亞簇，特別是對于CDCs來說，分為了5個亞簇(Fig. 2C)。為了更好地了解CDCs，研究了五個CDsC亞簇集群的GSEA。所有的細胞群都表現出主要的免疫調節特性，如“對細胞因子的反應” (Fig. 2D)。主要集群Cl4/7/3和Cl5/8兩者之間的主要區別CDCs的Cl5/8似乎參與更有活力過程（線粒體，細胞呼吸，Fig. 2D）。為了更好地了解CDCs與CFs、ECs或SMCs之間是否存在顯著的相似性，計算細胞相似性。在CDCs的樣本中出現了三個峰，其中，峰值明顯，第二峰值與CFs和SMCs相似度得分大致相同，最小峰值與SMC曲線的小峰平行(Fig. 2E)。到目前為止，sc-RNAseq結果顯示CDCs表現出最多的線粒體基因，并以分泌和免疫調節特征區別于CFs、SMCs和ECs。然而，CDCs也顯示出與非肌細胞類型的某些相似之處。

3、CDCs的單細胞RNA測序與分化的hESCs進行比較

為了更詳細地比較CDCs與真正的心臟祖細胞(CPCs)和早期心肌細胞(CMs)，納入了分化的人ESCs (hESCs)的單細胞轉錄組數據，以在hESC分化過程中繪制譜系決定的軌跡圖。hESC DIFF D6/D7/D8/D9/D15進行整合并生成UMAP圖(Fig. 2F, G)。無監督聚類產生了8個聚類(Fig. 2G)。CDCs與CPCs或TBX5、GATA4和NKX2-5明顯標記的早期CMs無重疊(Fig. 2F-H)。此外，CDCs與上皮細胞(群集5)或血管生成祖細胞(群集7)沒有重疊(Fig. 2F, G)。然而，CDCs在簇中與分化的hESCs重疊，顯示CF- (cluster 2)或增殖細胞(cluster 0,6)的特征(Fig. 2F, G)。有趣的是，早期定義的CDCs標志物如CXCL1、CXCL6和IL1B(圖2B)在這種情況下對CDCs具有高度特異性(Fig. 2I)。綜上所述，通過比較CDCs和分化的hESCs的sc-RNAseq數據，發現其與心臟祖細胞或早期心肌細胞沒有重疊。

圖2CDCs的單細胞RNA測序與主要的心臟非肌細胞類型(CFs、SMCs、ECs)和分化的hESCs進行比較。

4、sc-RNAseq對CDCs和右心房活檢的比較

接下來，試圖闡明CDCs在成人心臟中的起源細胞群。因此，使用來自四個不同個體的右心房人活組織切片，并進行了單核(RA-1, RA-2)或單細胞(RA-3，單核(sn) RNAseq數據。心肌細胞(CMs) 單核(sn) RNAseq數據用的是前人的研究。將Sn-和sc-RNAseq活檢數據與成人CDC sc-RNAseq數據進行整合，生成UMAP圖。首先，單細胞和單細胞核很好地聚集在一起，因此能夠在四個活檢樣本中識別所有主要的心臟細胞類型:CMs、CFs、ECs、SMCs/周細胞(PCs)、單核細胞/巨噬細胞(MPs)和B-/ t細胞(Fig. 3A–C)。新的CDCs標志物CXCL1/6/8和IL1B(圖2B)也在巨噬細胞、樹突狀細胞和肥大細胞中表達(CXCL6除外)( Fig. 3C)。有趣的是，CDCs位于CFs附近(Fig. 3A、B)。77%的CDCs甚至共享CF-1集群。23%的CDCs建立了自己的集群(Cl7: CDC-2)。與CF相比，CMs離CDCs較遠，EC和周細胞/SMCs離CDCs更遠。

因此，推測CDCs可能是CF細胞狀態的轉變。為了驗證這一點，試圖使用單細胞軌跡分析。在CDCs的兩個集群中(Cl7: CDC和Cl2: CF-1/CDC)，檢測到三個軌跡分支(編號為1、2和3) (Fig. 3D)。CDCs和CFs建立了三個主要的軌跡，其中cdc在偽空間的一端，CFs在另一端。為了了解其軌跡分支，研究了相關基因。為此，作者在Seurat中進行了額外的亞群分析，并分析了聚類0(映射到軌跡1)、7(映射到軌跡2)和12(映射到軌跡3)中的前25個特定基因(Fig. 3E)。GSEA表明，軌跡1主要與External encapsulating structure和ECM organization有關。軌跡2與locomotion and development有關。軌跡3，CDCs軌跡，與response to cytokine，immune system processes，secretion有關。

圖3 sc-/sn- RNAseq對CDC和人心房活檢的比較。

5、成人與嬰兒CDCs的分子特征比較

對來自新生兒或成人心房的人心肌細胞的再臨床研究表明，在免疫缺陷梗死大鼠心臟移植后，新生兒心肌細胞比成人心肌細胞具有更強的修復能力。新生兒CDCs維持心肌功能，防止不良重塑，促進血管生成。所以作者試圖闡明成人與嬰兒CDCs的分子特征的區別。有趣的是，基因表達分析顯示，與成人CDCs和嬰兒CFs相比，嬰兒CFs中心臟轉錄因子GATA4和TBX5的表達較低(Fig. 4A)。相比之下，NKX2-5在嬰兒組(CDCs和CFs)的表達顯著升高。CF標記物ALDH1A2在兩個年齡組中與嬰兒細胞相比在成人細胞中上調，與CDCs相比在CF中上調，S100A4在兩個年齡組中，與CFs比較，都是在CDCs中上調，THY1 (CD90)也是如此(Fig. 4B)。CXCL6在兩個年齡組的CDCs中均具有特異性，而miR-146a僅在嬰兒組中與CFs相比在CDCs中具有特異性(Fig. 4C)。兩個CDCs樣本(嬰兒和成人，圖4D)的無監督全局聚類，根據其特定的基因表達將CDCs細分為6個聚類(Fig. 4E)。在嬰兒和成人樣本之間主要有兩組(0,3)重疊(Fig. 4F)。通過計算細胞相似性，證實了嬰兒和成人CDCs樣本具有較高的相似性(Fig. 4G)。有趣的是，GSEA揭示了兩個集群的具有幾個相似的GO分類(Fig. 4H)。這些結果sc-RNAseq分析顯示新生兒CDCs參與心臟發育過程，而成人CDCs更多地參與免疫調節和分泌。

圖4成人與嬰兒CDCs的分子特征比較。

6、CDCs和CF來源的細胞外囊泡（EV）介導的旁分泌效應

分析CDCs的旁分泌作用，如促進血管生成和抗纖維化作用或抑制心肌細胞凋亡。將不同細胞來源的EV和不同類型的心肌細胞共孵育，檢測心肌細胞的管腔形成，結果發現，與CF-EV比較，CDC-EV顯著促進心肌細胞血管生成和運動能力（Fig. 5A–I）。

圖5 CDC和CF來源的細胞外囊泡介導的旁分泌效應。

綜上所述，本研究對培養的人原代細胞(CF、SMCs、ECs和CDCs)進行Sc-RNAseq分析，揭示了其分子特性的詳細圖像。CDCs是一種線粒體豐富的細胞類型(線粒體基因含量高)，與CFs、SMCs和ECs的區別主要在于其分泌和免疫調節特性(Fig. 6)。

圖6 CDCs的分子鑒定

參考文獻：

Kogan, PS., Wirth, F., Tomar, A. et al. Uncovering the molecular identity of cardiosphere-derived cells (CDCs) by single-cell RNA sequencing. Basic Res Cardiol 117, 11 (2022). https://doi-org.blk.80599.net/10.1007/s00395-022-00913-y