轉(zhuǎn)移是宮頸癌致死的主要原因，但迄今為止，還沒有有效的治療方法來阻止轉(zhuǎn)移。circRNAs被發(fā)現(xiàn)與癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)。在本研究中，我們在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)了一個來自宿主基因Gli1的表達下調(diào)的circRNA (hsa_ circ_0005358)，該circRNA在有頸外轉(zhuǎn)移的組織中表達量低于無頸外轉(zhuǎn)移的組織。上調(diào)hsa_circ_0005358可顯著抑制宮頸癌細胞的體外遷移和侵襲，下調(diào)hsa_circ_0005358則相反。小鼠模型顯示過表達hsa_ circ_0005358的宮頸癌細胞在體內(nèi)具有較弱的轉(zhuǎn)移潛能。RNA下拉分析、質(zhì)譜分析和RNA免疫沉淀驗證了hsa_circ_0005358通過其215-224序列發(fā)揮作用，該序列與PTBP1相互作用。RNA測序分析顯示，CDCP1是hsa_circ_0005358和PTBP1的共同靶點。我們進一步證實，hsa_circ_0005358隔離了PTBP1，阻止其穩(wěn)定CDCP1 mRNA，減少CDCP1蛋白翻譯，最終抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。我們的研究結(jié)果揭示了hsa_ circ_0005358在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，這可能為轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者提供一種潛在的治療方法。本文于2021年11月發(fā)表于“Molecular Therapy: Nucleic Acids”（IF=8.886）。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）hsa_circ_0005358的識別和特征

在我們前期的研究中，對12份頸標本進行了circRNA測序分析(GEO: GSE147009)，其中包括6個正常宮頸組織和6個宮頸癌組織。測序結(jié)果顯示共有257個circRNA在宮頸癌組織中顯著下調(diào) (圖1A)。我們集中研究了宮頸癌組織中15個差異最大的下調(diào)circRNA。考慮到hsa_circ_0005358是宮頸癌組織中表達最明顯的circRNA之一，且在不同的引物中特異性最大，我們選擇hsa_circ_0005358進行進一步研究。基因組結(jié)構(gòu)表明，hsa_circ_0005358是由人類Gli1基因(chr12:57,861,115-57,862,007)生成的(圖1B)。我們利用SiHa和CaSki兩株宮頸癌細胞株的cDNA和gDNA進行了PCR。如果沒有特定的環(huán)狀連接，當使用發(fā)散性引物時，gDNA不能擴增PCR產(chǎn)物(圖1C)。我們還設計了兩對引物對全長hsa_ circ_0005358進行擴增，并通過DNA凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行了驗證(圖1D)。在northern blot實驗中，使用靶向特異性連接的探針在SiHa和CaSki細胞中檢測到了內(nèi)源性hsa_circ_0005358的表達(圖1E)。此外，RNase R處理后，其宿主基因的mRNA表達顯著減少，hsa_circ_0005358對RNase R消化具有抗性(圖1F)，這表明hsa_circ_0005358 RNA是一種穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。RNA熒光原位雜交(FISH)(圖1G)和亞細胞分離試驗(圖1H)顯示，hsa_ circ_0005358主要位于SiHa和CaSki細胞的細胞核中，但也存在于細胞質(zhì)中。綜上所述，hsa_circ_0005358在宮頸癌細胞中是一個穩(wěn)定的circRNA。

2）Hsa_circ_0005358在體內(nèi)外均可作為宮頸癌轉(zhuǎn)移行為的抑制因子

為了探究hsa_circ_0005358的生物學功能，我們構(gòu)建了一個過表達hsa_circ_0005358的質(zhì)粒。采用Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力。過表達hsa_circ_0005358后，與對照細胞相比，SiHa和CaSki細胞的遷移和侵襲率均顯著降低(圖2A和2B)。傷口愈合檢測顯示，過表達hsa_ circ_0005358可導致間隙閉合減慢(圖2C)。CCK-8檢測顯示hsa_circ_0005358過表達和不過表達的細胞的增殖能力無顯著差異(圖2D)，說明過表達hsa_circ_0005358的細胞遷移和侵襲能力的降低并不是細胞增殖率降低的結(jié)果。

為了證實hsa_circ_0005358在體內(nèi)對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用，我們將穩(wěn)定過表達hsa_circ_0005358或?qū)φ蛰d體的SiHa細胞經(jīng)尾靜脈注射到雌性SCID小鼠體內(nèi)，并利用體內(nèi)成像技術(shù)，每周通過發(fā)光監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移情況。我們發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005358在注射4周后，與對照組相比，過表達hsa_circ_0005358顯著抑制SiHa細胞的轉(zhuǎn)移(圖2E和2F)。H&E染色組織學顯示肺轉(zhuǎn)移灶的典型形態(tài)(圖2G)。hsa_circ_0005358過表達組的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量明顯少于對照組(圖2H)。此外，與正常宮頸組織相比，hsa_circ_0005358在宮頸癌組織中明顯缺失，而宮頸外侵襲或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(FIGO II期或以上)的腫瘤樣本中hsa_ circ_0005358的表達量明顯低于宮頸腫瘤樣本(FIGO I期)(圖2I)。綜上所述，hsa_ circ_0005358是宮頸癌轉(zhuǎn)移的抑制因子。

3）hsa_circ_0005358直接與PTBP1相互作用

hsa_circ_0005358序列的生物信息學分析表明hsa_circ_0005358可能與RBP相互作用。為了探索hsa_circ_0005358的蛋白伴侶，我們進行了RNA-pull-down分析。結(jié)果顯示在hsa_circ_0005358探針道中約55-70 kDa處有一條明顯的條帶(圖3A)。質(zhì)譜結(jié)果證實，該差異帶的主要成分為PTBP1，這是宮頸癌中上調(diào)的基因。western blot分析(圖3B)和RIP分析(圖3C)顯示hsa_circ_0005358和PTBP1之間存在相互作用。RNA-pull-down分析(圖3D)和RIP分析(圖3E)表明，hsa_circ_0005358過表達時，hsa_circ_0005358與PTBP1之間的相互作用更強。接著，我們利用生物信息學分析預測了hsa_circ_0005358和PTBP1之間的5個潛在結(jié)合位點，然后構(gòu)建了5個針對每個結(jié)合位點的突變circRNA質(zhì)粒(Mut1-Mut5)和另一個包含所有潛在突變結(jié)合位點的質(zhì)粒(Mut6)(圖3F)。這些突變都沒有影響hsa_circ_0005358的圓形結(jié)構(gòu)。如圖3 G和3 H，Mut1、Mut2和Mut3質(zhì)粒的過表達顯著抑制了SiHa和CaSki細胞的遷移和侵襲，而Mut4、Mut5和Mut6則喪失了這種功能，說明Mut4和Mut5所在的序列215-224是hsa_- circ_0005358功能所必需的。我們將序列215-224突變的hsa_circ_0005358質(zhì)粒命名為Mut-hsa_circ_0005358(圖3I)。RNA下拉分析顯示，PTBP1在SiHa和CaSki過表達Mut-hsa_circ_0005358的細胞中富集程度低于過表達野生型hsa_circ_0005358的細胞(圖3J)。RIP檢測和qRT-PCR顯示，Mut-hsa_circ_0005358不能被PTBP1捕獲(圖3K)。過表達Mut-hsa_circ_0005358的細胞表現(xiàn)出與對照細胞相似的遷移和侵襲能力(圖3L和3M)。我們的結(jié)果表明，hsa_circ_0005358通過序列215-224直接與PTBP1結(jié)合來實現(xiàn)功能。

4）hsa_circ_0005358通過與PTBP1結(jié)合調(diào)控CDCP1的表達

由于hsa_circ_0005358作為誘餌作用于PTBP1，我們對hsa_circ_0005358過表達/未過表達的SiHa細胞和PTBP1沉默/未沉默的SiHa細胞進行了兩次 RNA-seq分析。RNA-seq分析獲得了99個RNA-seq-1的差異表達轉(zhuǎn)錄本和6027個RNA-seq-2的差異表達轉(zhuǎn)錄本。RNA-seq-1和RNA-seq-2的重疊進行了分析，并在聚類熱圖中顯示(圖4A和圖4B)。重疊基因中，有38個在hsa_ circ_0005358過表達和PTBP1沉默的細胞中表達趨勢相似。我們根據(jù)報道的這些基因的功能，進一步減少候選基因的數(shù)量，并選擇15個基因在SiHa和CaSki細胞中進行qRT-PCR進一步驗證(圖4C和4D)。LAMC2、CDCP1和SYTL2這三種mRNA的表達在過表達hsa_circ_0005358或沉默PTBP1的SiHa和CaSki細胞中均顯示出一致的變化趨勢(圖4E)。接下來，我們檢測了三種蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)CDCP1蛋白在過表達hsa_circ_0005358或沉默PTBP1的SiHa和CaSki細胞中的表達量比其他兩種蛋白的表達量下降更明顯(圖4F)。結(jié)果提示hsa_circ_0005358和PTBP1共同調(diào)控CDCP1的表達。

我們同時在SiHa和CaSki細胞中上調(diào)hsa_circ_0005358和CDCP1的表達，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005358過表達導致兩種細胞株的遷移和侵襲率降低，而CDCP1的上調(diào)抵消了這些影響(圖4G-4I)。此外，我們想知道hsa_circ_0005358是否以PTBP1依賴的方式調(diào)控CDCP1的表達。Mut-hsa_circ_0005358的過表達與CDCP1的表達水平類似于載體組(圖4J)。結(jié)合Mut-hsa_circ_0005358的表型，如圖3L和3M所示，這些結(jié)果表明上調(diào)的hsa_circ_0005358通過與PTBP1結(jié)合抑制CDCP1的表達，從而減弱宮頸癌細胞的侵襲性轉(zhuǎn)移行為。

5）hsa_circ_0005358阻止PTBP1與CDCP1 mRNA結(jié)合并使其穩(wěn)定

考慮到在我們的RNA-seq分析中，PTBP1基因的下調(diào)抑制了CDCP1 mRNA的表達，而Clip-seq數(shù)據(jù)庫暗示PTBP1直接與CDCP1 mRNA結(jié)合，我們推斷，PTBP1與CDCP1 mRNA的結(jié)合可能增強了CDCP1 mRNA的穩(wěn)定性。下拉試驗和RIP試驗驗證了在SiHa和CaSki細胞中PTBP1與CDCP1 mRNA結(jié)合(圖5A和5B)。接著，我們使用Act-D檢測SiHa和CaSki細胞中CDCP1 mRNA水平的衰減率。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，在SiHa和CaSki細胞中，PTBP1基因下調(diào)加速了內(nèi)源性CDCP1 mRNA的降解，降低了CDCP1蛋白水平，而PTBP1基因上調(diào)則相反(圖5C和5D)。結(jié)果表明，PTBP1結(jié)合并穩(wěn)定CDCP1 mRNA，從而提高CDCP1蛋白的表達。下拉試驗和RIP試驗表明，hsa_circ_0005358的過表達，而不是Mut-hsa_circ_005358的過表達，減少了CDCP1 mRNA對PTBP1的招募(圖5E)，降低了PTBP1抗體富集的CDCP1 mRNA水平(圖5F)，表明hsa_circ_0005358阻斷了PTBP1與CDCP1 mRNA的結(jié)合。接下來我們檢測Act-D處理后不同條件下CDCP1 mRNA的表達情況。如圖5G和圖5H所示，hsa_circ_0005358過表達，而不是Mut-hsa_circ_0005358過表達，加速了CDCP1 mRNA的衰減和蛋白合成的減速，hsa_circ_0005358和PTBP1共轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)了這一趨勢。綜上所述，hsa_circ_0005358抑制了PTBP1與CDCP1 mRNA的結(jié)合和穩(wěn)定，從而降低了CDCP1蛋白水平。

結(jié)論：在宮頸癌中，circRNA hsa_-circ_0005358的恢復阻礙了PTBP1與CDCP1 mRNA的結(jié)合和穩(wěn)定，導致CDCP1下調(diào)和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移機制，這可能為轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者提供一種潛在的治療方法。

參考文獻：Cen Y, Zhu T, Zhang Y, Zhao L, Zhu J, Wang L, Xu J, Ding T, Xie X, Wang X, Lu W. hsa_circ_0005358 suppresses cervical cancer metastasis by interacting with PTBP1 protein to destabilize CDCP1 mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2021 Nov 29;27:227-240. doi: 10.1016/j.omtn.2021.11.020. PMID: 34976440; PMCID: PMC8693350.