阿爾茨海默病（AD），即老年癡呆，是最常見的神經退行性疾病，目前尚無有效的治療方法。關于AD的機制和治療靶點的主流研究主要集中在兩個最重要的特征，Aβ和Tau，但臨床研究的結果并不令人鼓舞。小膠質細胞異常極化是AD進展過程中一個明顯的典型病理特征。小膠質細胞通過降解和去除Aβ和Tau蛋白具有神經保護作用。然而，在AD條件下，小膠質細胞轉化為促炎表型，降低小膠質細胞的吞噬活性，損傷神經元，促進AD的病理。作者之前報道miR-146a多態性與零星AD風險相關，鼻給藥miR-146a模擬物可減少AD的認知障礙和主要病理特征。然而，miR-146a通過何種機制抵抗AD的病理過程尚不清楚。本研究發現在APP/PS1轉基因小鼠中，小膠質細胞特異性miR-146a過表達可以減少學習和記憶的認知缺陷，減輕神經炎癥，降低Aβ水平，改善斑塊相關的神經炎病理，并防止神經元丟失。本文于2021年11月發表在《Theranostics》IF：11.556期刊上。

技術路線：

主要結果：

1、小膠質細胞特異性miR-146a過表達改善APP/PS1 Tg小鼠的學習和記憶認知缺陷

通過立體定位技術將腺相關病毒小膠質細胞miR-146a (AAV-M146a)注射至10月齡APP/PS1 Tg小鼠雙側海馬，評價其對AD潛在的治療作用(Figure 1A)。注射一個月之后檢測miR-146a是否在小膠質細胞中特異性表達。IF結果顯示APP/PS1-AAV-M146a組內源性miR-146a與Iba1共定位在海馬但不與NeuN或GFAP發生共定位(Figure 1B)，隨后RT-qPCR顯示miR-146a在小膠質細胞中高表達。以上表明miR-146a過表達AD小鼠構建成功。

隨后用水迷宮（MWM）和物體識別測試（ORT）判斷小鼠的認知能力。在ORT實驗中，miR-146a過表達組小鼠具有更好的認知行為表現（Figure 1D-E），在MWM實驗中，miR-146a過表達組小鼠也表現出顯著增加運動軌跡和較短的逃避潛伏期（Figure 1F-G），穿越平臺的次數和目標象限的游泳距離也顯著增加（Figure 1H-J）。這些結果表明小膠質細胞特異性miR-146a減輕AD小鼠模型的學習和記憶認知缺陷。

圖1小膠質細胞特異性miR-146a過表達改善APP/PS1 Tg小鼠的學習和記憶認知缺陷

2、小膠質細胞特異性miR-146a過表達減緩APP/PS1 Tg小鼠的神經炎癥和轉換小膠質極化

作為小膠質細胞的神經免疫響應，神經炎癥過程在AD發生發展過程中扮演著重要作用，因而檢測了典型的炎癥因子的水平。結果顯示，miR-146a過表達顯著減低了炎癥因子的表達，包括IL-1β, TNF-α, and IL-6 (Figure 2A)，并且顯著增加了小膠質細胞M2標志物的表達Arg1, IL-10, CD206, and TGF-β (Figure 2B)，而促炎因子和M1標志物則顯著下調(Figure 2C)；小膠質細胞標志物Iba1的蛋白表達顯著增加（Figure 2D-E）；MFG-E8蛋白表達水平無明顯變化(Figure 2F)，但其mRNA水平升高(Figure 2G)。還檢測了斑塊相關CD68的水平，這是小膠質細胞吞噬活性的標志，發現 miR-146a過表達后其表達顯著增加。以上結果表明小膠質細胞特異性miR-146a過表達減緩APP/PS1 Tg小鼠的神經炎癥和轉換小膠質極化。

圖2小膠質細胞特異性miR-146a過表達減緩APP/PS1 Tg小鼠的神經炎癥和轉換小膠質極化

3、小膠質細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠的Aβ水平和amyloid斑塊

Aβ是AD的經典病理特征之一，AD中小膠質細胞的極化與Aβ的吞噬作用密切相關。海馬Aβ與Aβ₄₂抗體染色顯示APP/PS1-AAV-M146a組與APP/PS1-AAV-Mcon組相比，Aβ顯著降低（Figure 3A）。然后用ELISA法檢測全腦裂解液中可溶性和不可溶性Aβ的含量，發現不可溶性Aβ₄₀和Aβ₄₂都顯著下降，而可溶性的則無明顯改變（Figure 3B-E）。用Thios染色檢測斑塊形成，結果表明過表達miR-146a之后Thios的數量顯著下降。以上結果提示小膠質細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠的Aβ水平和amyloid斑塊。

圖3小膠質細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠的Aβ水平和amyloid斑塊

4、小膠質細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠斑塊相關神經炎病理和神經元丟失

此前有研究報道AD患者和小鼠模型中神經突營養不良與Aβ沉積密切相關，而AD小鼠模型中miR-146a過表達是否減輕了這一表型尚未被研究。發現與對照相比，過表達miR-146a后，抗APP的N末端抗體標記損傷的神經突，顯示營養不良的神經突顯著減少（Figure 4A–B）；海馬和皮質中神經元數量增加（Figure 4C–E）；凋亡的神經元數量減少（Figure 4G–H）。以上結果表明小膠質細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠斑塊相關神經炎病理和神經元丟失。

圖4小膠質細胞特異性miR-146a過表達降低AD小鼠斑塊相關神經炎病理和神經元丟失

5、在Aβ₄₂誘導的細胞模型中，miR-146a水平升高觸發小膠質細胞表型轉換

在證實miR-146a過表達在體內將小膠質細胞從M1轉化為M2后，進一步在體外證實這些結果，并試圖確定miR-146a與小膠質細胞炎癥反應之間的關系。結果發現，在Aβ₄₂誘導下，過表達miR-146a后，由M1表型小膠質細胞產生的促炎因子TNF-α, IL-1β, and IL-6的水平都顯著下降(Figure 5A–B)；相反的，M2極化標志物和抗炎因子都顯著升高(Figure 5C)。在Aβ₄₂誘導下，與對照抑制劑組相比，miR-146a抑制劑組TNF-α、IL-1β和IL-6均未明顯下降(Figure 5D–E)。Arg1 or TGF-β的水平也未觀察到明顯下降(Figure 5F)。這些結果表明miR-146a在A_β42誘導下可觸發小膠質細胞降低促炎表型，增強吞噬表型。

圖5-1在Aβ₄₂誘導的細胞模型中，miR-146a水平升高觸發小膠質細胞表型開關

6、在Aβ₄₂誘導的細胞模型中，miR-146a水平升高增強小膠質細胞吞噬作用

隨后，探究miR-146a過表達能否提高小膠質細胞的吞噬作用。Aβ₄₂處理的小膠質細胞表現出變形蟲表型，其面積、Feret直徑和周長均顯著高于對照組，而Aβ₄₂誘導前小膠質細胞內miR-146a水平過表達時，小膠質細胞呈圓形或梭形，面積、Feret直徑和周長均較NC模擬組降低(Figure 5G–J)。相反，當在Aβ₄₂誘導神經炎癥前抑制miR-146a的表達，與模擬NC組相比，小膠質細胞面積、Feret直徑和周長均無明顯降低(Figure 5N–Q)。此外，使用聚苯乙烯微球來評估小膠質細胞的一般吞噬活性，并確保測量的是吞噬作用而不是胞飲作用，結果顯示，與NC組相比，miR-146a過表達組的吞噬活性顯著增強(Figure 5K)，而miR-146a抑制劑的小膠質細胞在Aβ₄₂誘導的吞噬活性下表現出不顯著的吞噬活性(Figure 5R)。此外，還檢測了MFG-E8，這是介導巨噬細胞吞噬凋亡細胞的關鍵因子，結果顯示Aβ₄₂刺激后MFG-E8水平無明顯變化，但miR-146a模擬物使其水平升高(Figure 5L–M)。因此，這些結果表明在Aβ₄₂誘導的細胞模型中，miR-146a水平升高增強小膠質細胞吞噬作用。

圖5-2在Aβ₄₂誘導的細胞模型中，miR-146a水平升高增強小膠質細胞吞噬作用

7、miR-146a水平升高阻礙Aβ₄₂或LPS誘導的神經元凋亡

為了確定miR-146a是否能調節小膠質細胞的表型，從而減少神經元損傷，首先在體外用miR-146a模擬物或抑制劑處理HMC3細胞，然后加入A_β42激活小膠質細胞。反過來，以1:1的比例直接共培養HMC3和SH-SY5Y細胞，以評估神經元凋亡(Figure 6A–B)。流式結果顯示當A_β42作用于HMC-3細胞時，SH-SY5Y細胞凋亡率升高(Figure 6C–D)。然而，miR-146a過表達SH-SY5Y細胞的凋亡率在Aβ₄₂刺激下下降(Figure 6C，E)；miR-146a抑制劑處理則相反(Figure 6D，F)。這些結果說明miR-146a水平升高阻礙Aβ₄₂誘導的神經元凋亡。

圖6 miR-146a水平升高阻礙Aβ₄₂或LPS誘導的神經元凋亡

8、鑒定到小膠質細胞過表達miR-146a的小鼠腦內神經炎癥相關基因特征

為了探討小膠質細胞miR-146a過表達對AD代謝通路的影響，特別是對神經炎癥相關信號通路的影響，分析了APP/PS1-AAV-M146a和APP/PS1-AAV-Mcon小鼠的大腦樣本的轉錄數據(Figure 7A)。如Figure 7B所示，幾個炎癥相關基因，如Oas1g、CD36和Cxcl10，均在上調量最高的基因中，表明miR-146a在神經炎癥中起著中心作用。自組織映射(SOM)聚類也確定了參與神經炎癥的基因(Figure 7C)。將這些基因按照APP/PS1-AAV-M146a和APP/PS1-AAV-Mcon小鼠組的表達水平進行分組。APP/PS1-AAVM146a小鼠組高表達基因的GSEA顯示其在神經元凋亡過程和免疫系統過程負調控等生物學過程中富集(Figure 7E)，而AD對照組小鼠組則表現為凋亡過程(Figure 7D)。KEGG顯示差異表達基因主要富集在“immune response”, “immune system process”,“defense response”, and “cell response to interferon”通路(Figure 7G) ，提示miR-146a在AD的發展過程中對免疫應答具有重要作用。

圖7鑒定到小膠質細胞過表達miR-146a的小鼠腦內神經炎癥相關基因特征

綜上所述，本文報道了小膠質細胞特異性miR-146a過表達可能是一種新的有價值的AD治療方法。在APP/PS1 Tg小鼠中，高水平的小膠質細胞特異性miR-146a表達可減少學習和記憶的認知障礙，減輕神經炎癥，降低Aβ水平，并防止神經元丟失。值得注意的是，miR-146a已被證明能增加AD條件下的小膠質細胞轉化，降低促炎表型，增加吞噬表型，并保護神經元。本文結果為miR-146a是AD和其他小膠質細胞相關疾病的一個有希望的靶點提供了證據。

參考文獻：

Liang Chunmei., Zou Ting., Zhang Miaoping., Fan Weihao., Zhang Tianzhen., Jiang Yuling., Cai Yujie., Chen Feng., Chen Xiongjin., Sun Yuanhong., Zhao Bin., Wang Yan., Cui Lili.(2021). MicroRNA-146a switches microglial phenotypes to resist the pathological processes and cognitive degradation of Alzheimer's disease. Theranostics, 11(9), 4103-4121. doi:10.7150/thno.53418