骨轉移是乳腺癌的常見癥狀，目前的靶向治療效果有限。破骨細胞在促進骨溶解和腫瘤細胞的轉移生長中起著關鍵作用。此前，我們發現CST6是骨轉移性乳腺癌細胞中顯著下調的分泌蛋白。功能分析顯示CST6在動物模型中具有抑制乳腺骨轉移的作用。然而，CST6在骨轉移中的作用機制和治療潛力尚不清楚。我們研究發現CST6通過抑制破骨細胞的生成來抑制骨溶解性轉移。癌細胞來源的CST6通過內吞作用進入破骨細胞，抑制半胱氨酸蛋白酶CTSB，導致CTSB水解底物SPHK1上調。SPHK1通過抑制RANKL誘導的p38激活來抑制破骨細胞的成熟。重組CST6蛋白在體內和體外均能有效抑制骨轉移。我們進一步鑒定了幾種模仿CST6功能的肽段，以抑制癌細胞誘導的破骨細胞形成和骨轉移。CTS6重組蛋白和多肽的臨床前分析證實了它們在乳腺癌骨轉移治療中的潛力。本文于2021年10月發表在“Theranostics”（IF: 11.556）期刊上。

技術路線

結果

1）CST6抑制乳腺癌細胞的破骨細胞形成和骨定植

   之前我們發現CST6抑制乳腺癌骨轉移，并觀察到在表達CST6的癌細胞引起的轉移中破骨細胞的減少。為了進一步評估腫瘤來源的CST6對破骨細胞形成的影響，CST6在SCP2中過表達。TRAP染色顯示，CST6過表達大大降低了CM誘導的骨髓細胞破骨細胞的成熟(圖1A)。相反，敲除CST6增強SCP4 CM誘導骨髓細胞破骨細胞發生的能力(圖1B)。重要的是，通過將這些癌細胞心內注射到小鼠體內的異種移植瘤轉移分析顯示，CST6顯著減少了腫瘤-骨界面上TRAP+破骨細胞的數量，抑制了骨基質的破壞，導致骨轉移的抑制(圖1C-G)。這些數據驗證了腫瘤來源的CST6在骨微環境中調節骨轉移的破骨細胞的作用。

   為了闡明細胞外CST6調控破骨細胞的直接細胞靶點，我們表達和純化了人CST6重組蛋白，然后用含有CST6蛋白的RANKL培養基培養小鼠骨髓細胞，進行破骨細胞生成實驗。結果顯示，人重組CST6顯著抑制RANKL誘導的骨髓細胞向破骨細胞的分化，且呈劑量依賴關系(圖1H)。小鼠重組CST6蛋白對破骨細胞的發生也有類似的抑制作用(圖1H)。我們進一步使用破骨前細胞RAW264.7細胞株進行破骨細胞生成分析，并觀察重組CST6蛋白對細胞破骨分化的抑制作用(圖1I)。一些破骨細胞分化的標記基因，包括Caclr, Nfatc1, Acp5, Ctsk和Fos，也被CST6下調(圖1J)。此外，重組CST6對破骨細胞生成的抑制可以被CST6中和抗體挽救(圖1I, J)。總的來說，這些數據表明CST6直接靶向破骨細胞譜系的細胞，而不是腫瘤細胞，以調節破骨細胞的發生。

2）CST6抑制CTSB酶活性抑制破骨細胞

   為了研究CST6調控破骨細胞生成的蛋白酶靶標，我們克隆了CST6蛋白的點突變N64A (CST6△N)和W135A (CST6△W)。酶活性測定證實，CST6△N和CST6△W分別只能抑制組織蛋白酶和LGMN，而雙突變體CST6△NW對蛋白酶均無抑制作用(圖2A)。值得注意的是，CST6△N和CST6△NW完全失去抑制破骨細胞生成能力，而CST6△N抑制破骨細胞的成熟(圖2B, C)。體內轉移研究還表明，W135A突變，但不是N64A突變減少CST6對破骨細胞和骨轉移的抑制作用(圖2D,E)。進一步，我們發現選擇性的CTSB抑制劑CA-074Me能夠抑制原代骨髓細胞和RAW264.7細胞的破骨細胞分化(圖2F, G)。此外，用siRNA在小鼠原代骨髓細胞中敲除CTSB也顯著抑制破骨細胞的發生(圖2H)。綜上所述，CTSB抑制可介導CST6在破骨細胞形成中的作用。

   組織蛋白酶是溶酶體蛋白酶，在酸性環境中僅在細胞內起作用。為了驗證胞外來源的CST6對破骨細胞胞內CTSB活性有抑制作用，將RAW264.7細胞置于含重組CST6蛋白的培養基中培養。結果表明，CST6處理確實抑制了RAW264.7細胞內的CTSB活性(圖2I)。更重要的是，在細胞外處理CST6后，觀察到CST6蛋白在RAW264.7細胞內逐漸積累(圖2J)。用內吞抑制劑Dynasore處理RAW264.7后，CST6在細胞內的積累呈劑量依賴性(圖2K)。內吞抑制也挽救了CST6抑制的RAW264.7細胞的破骨細胞發生(圖2L)。這些結果提示細胞外CST6蛋白可通過內吞作用被破骨前期細胞內化，抑制CTSB和破骨細胞分化。

3）CST6在破骨細胞中穩定SPHK1并抑制p38

   為了進一步闡明CTSB在破骨細胞調控中的下游機制，我們搜索了肽酶數據庫MEROPS，發現SPHK1是CTSB的底物之一。我們觀察到CTSB敲除增加了SPHK1在原代骨髓細胞中的表達(圖3A)。用CST6蛋白或CTSB抑制劑CA-074Me處理RAW264.7細胞或以劑量依賴的方式穩定細胞內SPHK1蛋白（圖3B）。在RAW264.7中過表達SPHK1顯著抑制細胞向破骨細胞的分化，而敲低SPHK1則表現出相反的效果(圖3C)。值得注意的是，在原代骨髓細胞中同時敲除SPHK1和CTSB(圖3D)可以逆轉CTSB抑制引起的破骨細胞發生的抑制(圖3E, F)。同樣，敲除SPHK1也可以恢復被重組CST6抑制的RAW264.7的破骨細胞發生(圖3G，圖3H)。這些結果表明CST6通過上調SPHK1來抑制破骨細胞的發生。

   先前的研究表明，RANKL誘導的p38信號通路激活對破骨細胞的成熟至關重要，SPHK1使p38失活。我們觀察到RANKL處理導致破骨前期細胞的p38磷酸化，而CTSB敲除和SPHK1在破骨前期細胞中的過表達阻斷了RANKL的這種作用，抑制了p38磷酸化(圖3I)。此外，用CST6過表達癌細胞的CM處理破骨前期細胞也降低了破骨前期細胞中RANKL誘導的p38磷酸化(圖3J)。為了進一步驗證p38信號通路在CST6抑制破骨細胞發生中的作用，我們使用p38抑制劑SB203580治療在癌細胞CM中培養的RAW264.7細胞。我們發現，在癌細胞中敲除CST6可以增強CM誘導的p38磷酸化和RAW264.7破骨細胞的成熟，而SB203580處理則表現出相反的效果(圖3K, L)。綜合來看，我們的數據表明，CST6可以抑制CTSB的活性并穩定SPHK1，導致p38活化和破骨細胞成熟的抑制。

4）重組CST6蛋白抑制乳腺癌骨轉移

   我們檢測了重組CST6蛋白是否可以用于治療乳腺癌骨轉移。裸鼠預先接種SCP2癌細胞，每天靜脈滴注1 mg/kg重組CST6蛋白。以重組突變蛋白CST6△NW為陰性對照。CST6治療可有效緩解小鼠骨轉移(圖4A,B)，減少破骨細胞生成和骨破壞(圖4A,C)，延長小鼠生存(圖4D)。這些數據為CST6作為一種蛋白質藥物治療骨轉移性疾病的潛力提供了論據。

5）CST6多肽抑制破骨細胞形成和乳腺癌骨轉移

    多肽具有廣闊的臨床應用前景。因此，我們想要篩選更小分子尺寸的模擬CST6的肽段作為骨轉移的候選藥物。我們設計了一系列不同長度的多肽。我們發現分別為86和51個氨基酸長度的兩個含QLVAG的多肽GQ86和DQ51對CTSB有顯著抑制作用（圖5A），并且抑制骨髓細胞的破骨細胞形成，并具有與全長CST6蛋白相似的劑量依賴性作用（圖5B）。此外，這些重組蛋白和肽的破骨抑制性能與唑來膦酸相似或優于唑來膦酸(圖5B)。接著，我們進一步評估了多肽在小鼠體內抑制SCP2細胞骨轉移的作用。GQ86和DQ51在1 mg/kg的處理濃度下均能顯著抑制骨轉移和破骨細胞成熟，其效果與全長CST6相似(圖5C-E)。多肽治療也恢復了動物的體重并延長了動物的生存期(圖5F, G)。我們進一步將多肽與唑來膦酸和硼替佐米這兩種治療溶骨性骨病變的臨床藥物進行了比較。數據顯示，多肽在抑制骨轉移和延長動物生存方面的療效與這兩種藥物相似(圖5H, I)。

6）CST6蛋白和多肽的藥理研究

   我們對CST6蛋白和多肽進行了藥理評價。在小鼠中，DQ51比GQ86和CST6顯示出更長的血漿半衰期(圖6A)。急性毒性分析顯示，DQ51 (250 mg/kg)的最大耐受劑量(MTD)略高于GQ86和CST6 (200 mg/kg)。重要的是，這些候選藥物的MTD和中位致死劑量(LD50, 322.00-360.10 mg/kg)均顯著高于有效抑制骨轉移的劑量(1 mg/kg)。每天靜脈注射1 mg/kg劑量的多肽進行慢性毒性評估，4周后動物未見明顯異常。治療后，患者全身和心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、腎上腺、胸腺、卵巢、大腦等各器官的重量均無差異(圖6B)。這些器官的組織學檢查也未見異常(圖6C)。血液學分析也顯示治療小鼠基本正常(圖7)。這些數據表明CST6和相關肽，特別是DQ51治療溶骨性骨轉移的藥物安全性。

結論：CST6-CTSB-SPHK1信號通路在破骨細胞分化中的作用，為利用CST6多肽治療骨病提供了一個有前途的途徑。

參考文獻：

Li X, Liang Y, Lian C, Peng F, Xiao Y, He Y, Ma C, Wang Y, Zhang P, Deng Y, Su Y, Luo C, Kong X, Yang Q, Liu T, Hu G. CST6 protein and peptides inhibit breast cancer bone metastasis by suppressing CTSB activity and osteoclastogenesis. Theranostics. 2021 Oct 11;11(20):9821-9832. doi: 10.7150/thno.62187. PMID: 34815788; PMCID: PMC8581426.