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siRNA修飾的lncRNA納米藥物通過(guò)抑制心肌內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡治療心肌肥厚

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2022-01-24
本研究結(jié)果證實(shí)心臟微血管功能障礙與心肌肥厚和心肌肥厚時(shí)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)鐵死亡有關(guān)......


心臟微血管功能障礙與心肌肥厚相關(guān),最終可導(dǎo)致心力衰竭。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNAs)的異常調(diào)節(jié)被認(rèn)為是心肌肥厚的關(guān)鍵機(jī)制之一。本文發(fā)表在《Molecular Therapy-Nucleic AcidsIF8.886三月刊上。然而,lncRNA在心臟微血管功能障礙中的潛在作用和潛在機(jī)制尚未明確闡明。本研究結(jié)果證實(shí)心臟微血管功能障礙與心肌肥厚和心肌肥厚時(shí)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)鐵死亡有關(guān)。

 

技術(shù)路線:


主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

1、心肌肥厚時(shí)受損的心肌微血管發(fā)生鐵死亡

不同形式的死亡,如凋亡,自噬和壞死性凋亡都已被證明和心肌肥厚相關(guān)。這些結(jié)果表明不同形式的死亡方式可以共同作用于心肌肥厚,那么一些新的細(xì)胞死亡方式可能會(huì)被忽略。鐵死亡是一種鐵依賴的,非凋亡性細(xì)胞死亡,部分是由致死性脂質(zhì)ROS積累介導(dǎo)的。此外,鐵死亡參與心肌損傷?;谝陨献髡卟孪腓F死亡可能也參與了心肌肥厚。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵死亡相關(guān)蛋白ferrostatin-1 (Ferr-1)減少了心肌肥厚模型組心臟中脂質(zhì)過(guò)氧化的增加,通過(guò)檢測(cè)MDA和ptgs2水平(圖1A-B)。并且,Ferr-1處理減少了模型組心臟H2AX的表達(dá)(圖1C-D)。此外,電子顯微鏡下觀察到心肌微血管內(nèi)皮線粒體在AAC處理大鼠中顯著變形和萎縮,這是鐵死亡發(fā)生的典型標(biāo)志,而這些現(xiàn)象在Ferr-1處理后顯著減少(圖1E)。明膠-墨水染色顯示Ferr-1顯著增加了心臟微血管密度(圖1F),并可以改善心肌微血管功能,表現(xiàn)為p-eNOS蛋白,NO含量和cGMP增加(圖1G-1J)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)err-1處理減少了ROS、脂質(zhì)過(guò)氧化、ptgs2表達(dá)的增加(圖1K-1M),并增加了AngⅡ誘導(dǎo)的CMEC細(xì)胞活力(圖1N-1O),p-eNOS的表達(dá)(圖1R-1S),并增加了AngⅡ誘導(dǎo)的CMEC細(xì)胞中的NO含量。這些結(jié)果表明鐵死亡發(fā)生在心肌微血管損傷過(guò)程中,提示Ferr-1對(duì)肥厚性心臟的保護(hù)作用可能通過(guò)抑制鐵死亡來(lái)改善CMEC功能。

1抑制鐵死亡改善CMECs的功能

 

2、心肌肥厚心臟中MMP9/TIMP1比值失衡導(dǎo)致CMECs功能障礙

MMP9/TIMP1的失衡參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,作者的前期研究也發(fā)現(xiàn)心肌肥厚大鼠心臟和CMEC細(xì)胞中均存在MMP9/TIMP1失衡。在這里,作者證明TIMP1沉默導(dǎo)致MMP9表達(dá)顯著增加(圖2A-D),以及增加AngⅡ誘導(dǎo)的CMEC細(xì)胞活力(圖2E-F)。為探討MMP9/TIMP1失衡對(duì)CMECs功能的影響,采用免疫熒光和western blot檢測(cè)PECAM-1的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AngⅡ處理的CMECs中,PECAM-1的表達(dá)明顯缺失,而TIMP1的沉默顯著提高了PECAM-1的表達(dá)(圖2G-2I)。此外,Ang II抑制細(xì)胞遷移和管形成能力,p-eNOS表達(dá)和NO含量,而TIMP1沉默顯著反轉(zhuǎn)這些作用(圖2J-N)。這些結(jié)果表明MMP9/TIMP1失衡導(dǎo)致CMECs功能障礙。

2沉默TIMP1改善AngⅡ誘導(dǎo)的CMECs功能異常

 

3、MMP9/TIMP1比值失衡誘導(dǎo)CMECs鐵死亡通過(guò)激活TFR-1

隨后探究TIMP1沉默保護(hù)CMEC功能的機(jī)制。作者檢測(cè)了鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá),包括SLC7A11,GPx4,TFR-1,Fpn1,結(jié)果表明沉默TIMP1顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TFR-1表達(dá)的增加,但對(duì)SLC7A11,GPx4,Fpn1蛋白表達(dá)沒(méi)有影響 (3A-B)。進(jìn)一步研究表明,沉默TIMP1顯著降低了鐵離子水平,ROSMDA的含量,以及ptgs2 mRNA的表達(dá)(圖3C-3F)。圖3G表明沉默TIMP1可以抑制CMECs細(xì)胞的死亡。提示MMP9/TIMP1比值的降低通過(guò)激活TFR-1導(dǎo)致CMEC鐵死亡。

3沉默TIMP1抑制CMEC鐵死亡通過(guò)下調(diào)TFR-1

 

4、miR-30b-5p抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CMECs的鐵死亡

通過(guò)在線軟件發(fā)現(xiàn)miR-30b-5p與TIMP1的3’UTR區(qū)域有互補(bǔ)配對(duì)序列(圖4A)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)揭示miR-30b-5p能夠抑制野生型(WT) TIMP1的熒光素酶活性,而TIMP1 3’UTR的突變形式對(duì)miR-30b-5p的反應(yīng)較弱(圖4B)。心肌肥厚大鼠心肌組織和Ang II誘導(dǎo)的CMECs中miR-30b-5p降低(圖4C-4D)。下一步將miR-30b-5p mimic和AMO-miR-30b-5p轉(zhuǎn)染至CMECs,檢測(cè)miR-30b-5p對(duì)CMECs鐵死亡反應(yīng)的影響(圖4E)。在Ang II-induced CMECs,過(guò)表達(dá)miR-30b-5p導(dǎo)致TIMP1和TFR-1蛋白表達(dá),ROS和MDA含量,鐵離子濃度,ptgs2的mRNA水平顯著降低,并顯著提高細(xì)胞生存能力和MMP9的蛋白表達(dá),而這些效果能被AMO-miR-30b-5p逆轉(zhuǎn)(圖4F-M)。表明過(guò)表達(dá)miR-30b-5p可顯著抑制暴露于Ang II的CMECs的鐵死亡。然而,AMO-miR-30b-5p抑制了miR-30b-5p對(duì)CMECs的保護(hù)作用(圖4N)。

隨后,lncRNA的ceRNA機(jī)制調(diào)控引miR-30b-5p起了作者的興趣。作者發(fā)現(xiàn)有11個(gè)lncRNA與miR-30b-5p共享一個(gè)高度保守的結(jié)合位點(diǎn)。檢測(cè)了這11個(gè)lncRNA在心肌肥厚大鼠心肌組織中的表達(dá)變化,結(jié)果顯示lncRNA AC115159.2、lncRNA AABR07017145.1 (lncRNA AAB)和lncRNA AABR07030334.1的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(圖4O)。qRT-PCR檢測(cè)這三種lncRNA在CMECs中對(duì)Ang II處理的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)在這些lncRNA中,只有l(wèi)ncRNA AAB顯著升高(圖4P)。圖4Q展示了lncRNA AAB和miR-30b-5p之間的結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示,miR-30b-5p可抑制TIMP1的熒光素酶活性,但該抑制可被lncRNA AAB逆轉(zhuǎn),AAB-mut突變形式對(duì)TIMP1的熒光素酶活性影響較?。▓D4R)。這些結(jié)果表明lncRNA AAB通過(guò)與miR-30b-5p相互作用,進(jìn)而調(diào)控CMECs的鐵死亡。

4 miR-30b-5p抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CMECs的鐵死亡

 

5、納米復(fù)合物的制備、表征和細(xì)胞攝取

因此,如果能夠通過(guò)納米復(fù)合物有效地傳遞lncRNA AAB的小干擾RNA (siRNA),就有可能抑制CMECs的鐵死亡。接下來(lái),作者展示了納米復(fù)合物的制備和表征。如圖5A所示,中性粒細(xì)胞膜(NM) + si-AAB +單聚二氧化硅納米復(fù)合物(MSN)清楚地表現(xiàn)出真核細(xì)胞樣結(jié)構(gòu),最外層為淺灰色的軟層,厚度為10 nm,與活細(xì)胞膜的厚度一致。所得到的MSNs為均勻的納米球,平均粒徑約為100 nm,如掃描電鏡圖像所示(圖5B-5C)。將孔徑調(diào)整到適合siRNA負(fù)載的大小,表面積保證了siRNA的高負(fù)載能力。此外,MSNs可進(jìn)行生物降解當(dāng)在胎牛血清中孵育24 h,這對(duì)體內(nèi)藥物有效的釋放和減少機(jī)體免疫副作用和積累具有重要意義。通過(guò)zeta電位的測(cè)定來(lái)研究MSN的表面修飾和電荷變化。當(dāng)MSN上載siRNA時(shí),zeta電位下降到-14.6±1.06 mV,這與siRNA的負(fù)電荷有關(guān)(圖5D)。為了進(jìn)一步證實(shí)MSNs的介孔結(jié)構(gòu),檢測(cè)了MSNs納米粒子的比表面積和孔徑。值分別為519 m2 g?1和2.4 nm左右排列良好的介孔(圖5E插圖),可以滿足后續(xù)siRNA的加載。x射線衍射(XRD)圖顯示,由于MSNs是無(wú)定型的,所以MSNs沒(méi)有明顯的峰值,但在2θ(22°)處有一個(gè)寬衍射峰(圖5F)。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳,觀察到細(xì)胞膜和NM + si-AAB + MSN樣品中LFA-1和β2整合素的條帶(圖5G)。LFA-1和β2整合素的存在,保證了NM + si-AAB +MSN對(duì)損傷CMECs的有效靶向作用。

為了證明Ang II可以誘導(dǎo)CMECs損傷和炎癥,通過(guò)western blot檢測(cè)了ICAM-1的水平(圖5H-5I)。為了證明NM + si-AAB + MSN對(duì)CMECs的特異性識(shí)別和靶向傳遞,使用Ang II誘導(dǎo)CMs和CMECs損傷,然后和NM + si-AAB + MSN共孵育,并進(jìn)行染色。在CM中觀察到的FITC信號(hào)較弱,表明對(duì)NM + si-AAB + MSN的攝取較少,而在CMEM中,F(xiàn)ITC信號(hào)增強(qiáng)了3.8倍(圖5J-5K)。此外,細(xì)胞攝取si-AAB + MSN和NM + si-AAB + MSN的結(jié)果經(jīng)過(guò)流式分析,發(fā)現(xiàn)NM + si-AAB + MSN組的攝取信號(hào)顯著增加(圖5L-5M)。以上表明NM + si-AAB + MSN可以被CMEM特異性獲取。

5納米復(fù)合物的準(zhǔn)備和鑒定

 

6、NM + si-AAB + MSN抑制CMEM鐵死亡通過(guò)上調(diào)miR-20b-5p

圖6A展示了細(xì)胞內(nèi)化和納米復(fù)合物細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)解構(gòu),包括靶向識(shí)別、細(xì)胞內(nèi)化、胞內(nèi)細(xì)胞膜分離,和NM + si-AAB + MSN的降解以及siRNA釋放。在這種良好的減少反應(yīng)下,NM + si-AAB + MSN可以有效地沉默CMECs中l(wèi)ncRNA AAB的表達(dá),當(dāng)siRNA劑量為30 nM時(shí)可以抑制超過(guò)70%的lncRNA AAB的表達(dá)(圖6B)。圖6C和圖6D顯示,和AngⅡ組相比,si-AAB + MSN和NM + si-AAB + MSN組的CMEM細(xì)胞活力顯著增加。圖6E表明AngⅡ誘導(dǎo)導(dǎo)致CMEM細(xì)胞的PECAM-1不完全染色,而si-AAB + MSN和NM + si-AAB + MSN組的外周染色均勻。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)si-AAB + MSN和NM + si-AAB + MSN顯著上調(diào)miR-30b-5p的表達(dá)和MMP9的蛋白表達(dá),下調(diào)TIMP1和TFR-1的蛋白表達(dá)(圖6F-6H)。與Ang II組相比,si-AAB組的鐵離子、ROS、MDA、ptgs2水平和細(xì)胞死亡幾乎沒(méi)有變化,而si-AAB +MSN和NM + si-AAB +MSN組的鐵離子、ROS、MDA、ptgs2水平和細(xì)胞死亡明顯降低,且NM + si-AAB +MSN組最低,表明NM + si-AAB +MSN可以有效抑制鐵死亡(圖6I-6M)。這些結(jié)果表明,NM + si-AAB + MSN通過(guò)上調(diào)miR-30b-5p對(duì)Ang II暴露的CMECs的鐵死亡抑制作用最有效。

6通過(guò)NM+si-AAB+MSN沉默lncRNA AAB反轉(zhuǎn)CMEC的鐵死亡

 

7NM+si-AAB+MSN修復(fù)心肌肥厚的心肌微血管內(nèi)皮的損傷

AAC處理建立心肌肥厚動(dòng)物模型后,將心肌肥厚大鼠隨機(jī)分為4組。24 h后,心肌肥厚大鼠分別經(jīng)尾靜脈注射PBS、si-AAB、si-AAB +MSN、NM + si-AAB +MSN,每2 d注射1次,連續(xù)4周(圖7A)。為了確保NM + si-AAB + MSN始終能夠靶向心臟,在AAC后的第3天、第9天和第27天測(cè)定了心肌組織中ICAM-1的蛋白水平。結(jié)果顯示,ICAM-1在這些不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(圖7B和7C)。然后,通過(guò)定量MSN熒光信號(hào)的生物成像研究了納米復(fù)合物在心臟的分布。si-AAB + MSN組心臟出現(xiàn)輕微熒光信號(hào);在NM + si-AAB + MSN組中,心臟中觀察到明顯信號(hào),表明納米復(fù)合物對(duì)受損的內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的靶向特異性(圖7D)。觀察NM + si-AAB +MSN對(duì)肥厚心臟微血管鐵死亡的體內(nèi)治療作用。電鏡觀察結(jié)果顯示,PBS處理模型組CMEC細(xì)胞線粒體萎縮(圖7E)。si-AAB組和si-AAB +MSN組的鐵離子水平變化不明顯,而NM + si-AAB +MSN組的鐵離子水平明顯下降,說(shuō)明NM + si-AAB +MSN對(duì)心肌微血管具有良好的抗鐵死亡作用。此外,NM + si-AAB + MSN可增加心肌微血管密度(圖7F),并在恢復(fù)LVEF和LVFS方面表現(xiàn)較好(圖7G-7I)。腦室組織病理學(xué)顯示與PBS處理模型組相比,只有NM + si-AAB + MSN組產(chǎn)生的截面積更小,表現(xiàn)出明顯的心臟形態(tài)保護(hù)作用(圖7J和7K)。與模型組相比,si-AAB和si-AAB +MSN組BNP和β-MHC蛋白水平變化不大,而NM + si-AAB +MSN組BNP和β-MHC蛋白水平顯著降低,表明NM + si-AAB +MSN在體內(nèi)能有效抑制心肌肥厚(圖7L-7M)。以上表明,M+si-AAB+MSN能在體內(nèi)修復(fù)心肌肥厚的心肌微血管內(nèi)皮的損傷。

7通過(guò)NM+si-AAB+MSN沉默lncRNA AAB抑制心肌肥厚

 

總之,如圖8所示,本研究通過(guò)合理設(shè)計(jì)納米復(fù)合物,實(shí)現(xiàn)了si-AAB高效加載和細(xì)胞膜覆蓋,從而有效地履行其對(duì)心肌肥厚內(nèi)皮損傷的精確修復(fù)功能。

8 NM+si-AAB+MSN通過(guò)抑制CMEC鐵死亡調(diào)節(jié)心肌肥厚的機(jī)制模型圖

 

參考文獻(xiàn):

Shi Pilong., Li Minghui., Song Chao., Qi Hanping., Ba Lina., Cao Yonggang., Zhang Meitian., Xie Yawen., Ren Jing., Wu Jiabi., Ren Ping., Sun Hongli.(2022). AABR07017145.1Neutrophil-like cell membrane-coated siRNA of lncRNA  therapy for cardiac hypertrophy via inhibiting ferroptosis of CMECs. Mol Ther Nucleic Acids, 27(undefined), 16-36. doi:10.1016/j.omtn.2021.10.024