在糖尿病皮膚中，巨噬細胞/自噬的失調有助于傷口愈合的延遲。N6-甲基腺苷(m6A) RNA修飾在調節自噬中發揮重要作用。本研究揭示了YTHDC1通過調節糖尿病角質細胞中SQSTM1核mRNA的穩定性來調節自噬的功能最終作用于皮膚傷口愈合。本文于2021年10月發表在《Autophagy》IF:16.016期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、SQSTM1是高糖處理的HaCaT細胞的關鍵基因

近來研究發現糖尿病患者的皮膚表皮組織明顯薄于對照組（Figure 1A,B）。為了尋找糖尿病皮膚表皮變薄的機制，用高糖處理角質細胞系HaCaT細胞?？紤]到高糖會對細胞產生額外的滲透壓力，甘露醇用于高糖的滲透控制對照。對兩組細胞進行轉錄組測序，獲得差異表達基因，其中與正常糖+甘露醇組比較，高糖組SQSTM1顯著下調 (Figure 1C, D)。為了挖掘關鍵基因，通過Cytoscape軟件的cyto-Hubba插件分析，發現SQSTM1是高糖處理HaCaT細胞中調控其他重要基因的潛在關鍵靶基因，具有較高的相關性(Figure 1E)。通過PPI獲得了包括SQSTM1在內的得分最高的基因模塊(Figure 1F)。此外，一部分可見通路與表皮、細胞因子和凋亡緊密連接的通路在KEGG網絡圖中展示了(Figure 1G)。以上表明SQSTM1是高糖處理的HaCaT細胞的關鍵基因。

圖1 SQSTM1是高糖處理的角質細胞的關鍵基因

2、高糖誘導SQSTM1下調并抑制角質細胞自噬

如Figure 2A所示，SQSTM1的mRNA表達以時間依賴的方式逐漸降低。由于SQSTM1是自噬關鍵基因，所以檢測了高糖對自噬的影響。結果表明，高滲應激對SQSTM1表達水平、MAP1LC3B/LC3B-II:-I比值、MAP1LC3B/LC3B-II:TUBB(微管蛋白β I類)的比值均無明顯影響。相比之下，短期高糖處理導致SQSTM1表達水平、MAP1LC3B/LC3B-II:-I比值和MAP1LC3B/LC3B-II: TUBB比值顯著降低（Figure 2B, C）。然后，通過串聯轉染mRFP-GFP-MAP1LC3B /LC3B檢測自噬通量。結果顯示高糖處理后自噬小體和自噬溶酶體的形成都顯著減少，表明自噬通路受損（Figure 2D-F）。為進一步驗證該結論，在其余角質細胞系NHEK中重復實驗，如Figure 2G-2K，結果得出一致的結論。隨后用投射電子顯微鏡觀察自噬水平，發現HaCaT細胞自噬活性在高血糖的短期慢性作用下受到明顯抑制（Figure 2L）。糖尿病病人和非糖尿病人皮膚樣本的免疫組化顯示，在長期糖尿病皮膚表皮中發現SQSTM1和MAP1LC3B/ LC3B的表達均減少(Figure 2M,N)。綜上，短期和長期高血糖均可誘導角化細胞中SQSTM1表達水平降低和自噬抑制。

圖2高糖誘導角化細胞SQSTM1下調和自噬通量受損

3、減少SQSTM1阻斷HaCaT細胞自噬通量

用siRNA構建SQSTM1敲除HaCaT細胞系(Figure 3A,B)。根據文獻，作者決定研究SQSTM1對HaCaT細胞KEAP1-NFE2L2通路的影響。結果顯示，敲除SQSTM1后HaCaT細胞中KEAP1表達上調，NFE2L2表達下調(Figure 3B,C)，高糖處理后期表達趨勢也如此(Figure 3D,E)。此外，敲除SQSTM1也導致自噬體形成抑制和自噬通量受損(Figure 3F-H)。這些結果表明SQSTM1在角質細胞自噬中的關鍵基因。

圖3減少SQSTM1阻斷角質細胞自噬通量

4、m6A reader蛋白YTHDC1與SQSTM1 mRNA的相互作用在高糖誘導的角質細胞中下降

隨后檢測發現高糖處理后SQSTM1 mRNA水平在細胞質和細胞核中都顯著下降（Figure 4A）。前期研究表明，m6A參與了細胞核中轉錄后基因的調控，因此，采用RNA點雜交方法檢測HaCaT細胞中m6A水平。觀察發現，短期高糖處理后，HaCaT細胞中m6A水平顯著降低(Figure 4B)。然后，細胞總RNA用于免疫沉淀m6A抗體，發現SQSTM1 mRNA被m6A抗體顯著下拉（Figure 4C）。

在各種m6A閱讀器中，核閱讀器YTHDC1被認為具有多種作用，包括調節mRNA剪接、加速mRNA輸出和加速轉錄本的衰退。因此，本研究假設YTHDC1參與了HaCaT細胞中SQSTM1表達的調控。首先，檢測YTHDC1蛋白是否與SQSTM1 mRNA相互作用。RIP-qPCR實驗表明，YTHDC1蛋白可與SQSTM1 mRNA相互作用(Figure 4D)。為了進一步證實這一結果，進行RNA親和分離，驗證了SQSTM1 mRNA與YTHDC1蛋白相互作用(Figure 4E)。然后，考慮YTHDC1的異常調節是否有助于HaCaT細胞中高糖誘導的SQSTM1的減少。為了研究這一假設，在HaCaT細胞中評估不同濃度的葡萄糖和甘露醇(滲透控制)處理48和72 h后YTHDC1的表達。與正常葡萄糖組和滲透對照組相比，短期中高糖和高糖處理組YTHDC1表達水平明顯下調(Figure 4F,G)。同樣，短期高糖處理導致NHEK細胞中YTHDC1下調(Figure 4H,I)。免疫組化染色結果顯示，慢性高血糖作用下，糖尿病皮膚表皮中YTHDC1水平降低(Figure 4J,K)。這些結果表明，在短期和長期高血糖狀態下，角化細胞中與SQSTM1 mRNA相互作用的m6A reader YTHDC1均降低。

圖4 m6A reader蛋白YTHDC1與角化細胞中的SQSTM1 mRNA相互作用

5、YTHDC1調節高糖處理的角質細胞中SQSTM1的表達和自噬通量

為了檢測YTHDC1對膠質細胞的生物學功能的影響，用siRNA敲除HaCaT中其表達（Figure 5A,B）。敲除YTHDC1表達導致細胞的凋亡比例增加，傷口愈合能力下降（Figure 5C-F）。表明YTHDC1影響角質形成細胞的生物學功能。

圖5YTHDC1影響角質形成細胞的生物學功能

推測YTHDC1可能在調控SQSTM1表達中發揮作用。為了進一步闡明二者的關系，研究YTHDC1對SQSTM1的影響。發現YTHDC1基因敲低導致SQSTM1 mRNA和蛋白表達水平和MAP1LC3B/LC3B-II:-I比率顯著降低，自噬體和自噬溶酶體的數量顯著減少（Figure 6A-C），表明敲除YTHDC1損害了自噬通量。隨后探究YTHDC1在高糖處理的角質細胞中對SQSTM1表達的調控作用。結果顯示高糖處理導致的角質細胞中YTHDC1和SQSTM1表達以及MAP1LC3B/LC3B-II:-I比率下降可以被YTHDC1過表達挽救（Figure 6G,H）。此外，高糖誘導導致的自噬通量減少也可以被YTHDC1過表達挽救（Figure 6I-K）。以上表明YTHDC1調節高糖處理的角質細胞中SQSTM1的表達和自噬通量。

圖6 YTHDC1的敲除降低了SQSTM1的表達和自噬通量

6、敲除YTHDC1可加速SQSTM1 mRNA的降解并抑制自噬通量

據報道，YTHDC1介導m6A修飾的mRNA的核輸出。因此，評價了SQSTM1 mRNA的表達水平。令人驚訝的是，結果顯示，敲除YTHDC1后，細胞核和細胞質中SQSTM1 mRNA均減少，但不影響ACTB和RNU6 1 mRNA在細胞核和細胞質中的相對表達水平（Figure 7A-C）。所以進一步檢測敲除YTHDC1是否影響細胞核和細胞質中SQSTM1 mRNA的穩定性。用放線菌素D抑制HaCaT細胞的轉錄。敲除YTHDC1可促進細胞核中SQSTM1 mRNA的降解，但不影響細胞質中SQSTM1 mRNA的穩定性（Figure 7D, E）。這些數據揭示了YTHDC1在維持細胞核中m6A修飾的mRNA的穩定性方面的新作用。

已知ELAVL1是一種RNA穩定蛋白，可與含有m6A修飾的mRNA相互作用。因此，本研究探究YTHDC1是否與ELAVL1協同調控SQSTM1的表達。免疫共沉淀結果顯示ELAVL1可與YTHDC1親和分離，反之亦然（Figure 7F,G），提示YTHDC1可與ELAVL1相互作用。此外，RNA親和分離和RIP-qPCR結果表明，ELAVL1與SQSTM1 mRNA相互作用(Figure 7H,I)。敲除ELAVL1基因導致SQSTM1 mRNA表達水平降低（Figure 7L）。這些數據表明，YTHDC1與ELAVL1相互作用并協同調節角質形成細胞中SQSTM1的表達。

圖7 YTHDC1協同ELAVL1調控SQSTM1的表達

7、下調YTHDC1可減少小鼠角質細胞的自噬并延遲傷口愈合

為了給YTHDC1和SQSTM1在高血糖慢性作用下糖尿病傷口愈合中的作用提供體內證據，對BKD-Leprem2Cd479/Nju (db/db)小鼠、糖尿病小鼠模型和年齡匹配的野生型(WT)小鼠進行研究。如免疫組化染色所示，與年齡匹配的WT小鼠相比，在db/db小鼠中檢測到YTHDC1, SQSTM1和MAP1LC3B/LC3B的下調（Figure 8A,B）。并且db/db小鼠的創面愈合率明顯延遲（Figure 8C,D）。為了研究YTHDC1和SQSTM1在皮膚創面愈合中的功能作用，采用siRNA的策略敲除小鼠皮膚中的內源性YTHDC1和SQSTM1基因（Figure 8E）。與WT-si-NC組相比，WT-si-Ythdc1組注射siRNA后YTHDC1、SQSTM1和MAP1LC3B/LC3B蛋白表達水平下調(圖8F,G)。在WT-si-Sqstm1組中，與WT-si-NC組相比，注射si-Ythdc1組或si-Sqstm1組的SQSTM1和MAP1LC3B/LC3B蛋白表達水平都下調（Figure 8F,G）。還觀察到注射si-Ythdc1或si-Sqstm1的小鼠皮膚創面愈合延遲（Figure 8H,I）。以上表明，在體內下調YTHDC1可減少小鼠角質細胞SQSTM1表達和自噬并延遲傷口愈合。

圖8降低YTHDC1表達抑制角質細胞的自噬和延遲糖尿病小鼠傷口愈合

參考文獻：

Liang Diefei., Lin Wei-Jye., Ren Meng., Qiu Junxiong., Yang Chuan., Wang Xiaoyi., Li Na., Zeng Tingting., Sun Kan., You Lili., Yan Li., Wang Wei.(2021). mA reader YTHDC1 modulates autophagy by targeting SQSTM1 in diabetic skin. Autophagy, undefined(undefined), 1-20. doi:10.1080/15548627.2021.1974175