骨肉瘤是一種高度侵襲性的癌癥，常見(jiàn)于兒童和青少年。對(duì)于轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性骨肉瘤仍然缺乏有效的治療方法。本研究報(bào)道了一種新的lncRNA在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，其有作為靶向治療的潛在靶點(diǎn)。本文發(fā)表在《Molecular Therapy Nucleic Acids》IF：8.886的2021年12月刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、lncRNA MELTF-AS1在骨肉瘤中上調(diào)，并與骨肉瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)

如圖1所示，作者分析TARGET數(shù)據(jù)庫(kù)骨肉瘤的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定了轉(zhuǎn)移組織和非轉(zhuǎn)移腫瘤組織的差異表達(dá)lncRNA，此外，MELTF-AS1的表達(dá)，與正常組織相比，在腫瘤中高表達(dá)；與非轉(zhuǎn)移的腫瘤組織相比，在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移組織中高表達(dá)；MELTF-AS1高表達(dá)和不良預(yù)后相關(guān)；它同時(shí)在多個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，但是在尤文氏肉瘤細(xì)胞系中卻沒(méi)有高表達(dá)，表明其特異性。

圖1 lncRNA MELTF-AS1在骨肉瘤中上調(diào)并與骨肉瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)

2、RREB1激活骨肉瘤中MELTF-AS1的轉(zhuǎn)錄

隨后作者為何MELTF-AS1的表達(dá)在骨肉瘤中升高。使用JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了可能與MELTF-AS1啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，其中RREB1的預(yù)測(cè)得分最高，而沉默RREB1之后，MELTF-AS1的表達(dá)顯著減少，過(guò)表達(dá)則相反（圖2A-B）。此外，RREB1的表達(dá)在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移組織中最高，其次是未轉(zhuǎn)移腫瘤，最后是正常組織，免疫組化可以清晰展示這一點(diǎn)（圖2C-D）。RREB1抗體的染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)表明，它可以直接結(jié)合MELTF-AS1的啟動(dòng)子區(qū)域（圖2E）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，當(dāng)RREB1過(guò)表達(dá)是，熒光素酶活性顯著增加，但是當(dāng)RREB1和啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)域敲除后，過(guò)表達(dá)RREB1也不能改變熒光素酶活性（圖2F）。這些表明RREB1激活骨肉瘤中MELTF-AS1的轉(zhuǎn)錄。

圖2 RREB1結(jié)合MELTF-AS1的啟動(dòng)子激活其轉(zhuǎn)錄

3、MELTF-AS1促進(jìn)骨肉瘤的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移

如圖3所示，干擾MELTF-AS1的表達(dá)，抑制骨肉瘤細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移和體內(nèi)腫瘤的轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)減少，轉(zhuǎn)移標(biāo)志物表達(dá)下降，且敲除MELTF-AS1后小鼠的總體生存率顯著提高。這些結(jié)果表明MELTF-AS1可促進(jìn)骨肉瘤的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移。

圖3 敲除MELTF-AS1抑制骨肉瘤的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移

4、MELTF-AS1在骨肉瘤中以ceRNA機(jī)制調(diào)控miR-485-5p

FISH和亞細(xì)胞分離的qRT-PCR分析結(jié)果顯示MELTF-AS1主要定位在細(xì)胞質(zhì)中（圖4A-B），因此，推測(cè)其可能作為ceRNA發(fā)揮功能，預(yù)測(cè)了可能具有潛在結(jié)合關(guān)系的miRNA并進(jìn)行生物素標(biāo)記MELTF-AS1探針的RNA pull-down實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4C所示，miR-485-5p和miR-665可以與MELTF-AS1直接結(jié)合，但因?yàn)榍罢叩慕Y(jié)合豐度更高，所以選擇miR-485-5p進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如預(yù)期地，沉默MELTF-AS1后miR-485-5p的表達(dá)顯著升高，過(guò)表達(dá)則相反（圖4D-E），RNA IP結(jié)果顯示MELTF-AS1和miR-485-5p都可以和AGO2蛋白直接結(jié)合，并且熒光素酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明兩者具有直接結(jié)合關(guān)系（圖4F-G）。此外，miR-485-5p在骨肉瘤組織中的表達(dá)與MELTF-AS1完全相反，和正常組織相比，在非轉(zhuǎn)移性腫瘤組織中下調(diào)表達(dá)，在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的組織中進(jìn)一步顯著下調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果表明MELTF-AS1在骨肉瘤中以ceRNA機(jī)制調(diào)控miR-485-5p。

圖4 miR-485-5p是MELTF-AS1的一個(gè)靶點(diǎn)

5、MELTF-AS1通過(guò)與miR-485-5p的相互作用調(diào)控MMP14的表達(dá)

通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP14是miR-485-5p的一個(gè)靶基因，熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者間具有直接結(jié)合關(guān)系（圖5A）。而沉默MELTF-AS1會(huì)顯著下調(diào)MMP14的表達(dá)，而當(dāng)MELTF-AS1沉默和miR-485-5p的抑制劑共同作用時(shí)MMP14的表達(dá)回復(fù)到接近正常水平（圖5B）。此外，過(guò)表達(dá)MELTF-AS1會(huì)導(dǎo)致MMP14的表達(dá)升高，但是與miR-485-5p同時(shí)過(guò)表達(dá)，則MMP14表達(dá)升高的趨勢(shì)被抑制（圖5C-D）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)MMP14的表達(dá)和MELTF-AS1的表達(dá)正相關(guān)，和miR-485-5p的表達(dá)負(fù)相關(guān)。總之，MELTF-AS1吸附細(xì)胞質(zhì)中miR-485-5p的表達(dá)，以ceRNA機(jī)制促進(jìn)MMP14表達(dá)。

圖5 MELTF-AS1通過(guò)與miR-485-5p的相互作用調(diào)控MMP14的表達(dá)

6、MELTF-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)MMP14促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移

如圖6所示，過(guò)表達(dá)MELTF-AS1增加了骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和遷徙，和轉(zhuǎn)移標(biāo)志物分子的表達(dá)，但是在過(guò)表達(dá)MELTF-AS1的同時(shí)，過(guò)表達(dá)miR-485-5p或者抑制MMP14的表達(dá)，則顯著減少了這種轉(zhuǎn)移能力的能加。表明MELTF-AS1是通過(guò)調(diào)節(jié)MMP14促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移。

圖6 MELTF-AS1表現(xiàn)出部分依賴于MMP14的促轉(zhuǎn)移特性

總之，如圖7所示，轉(zhuǎn)錄因子RREB1激活MELTF-AS1的轉(zhuǎn)錄，其海綿吸附miR-485-5p進(jìn)而上調(diào)靶基因MMP14的表達(dá)，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的獲得。

圖7 本研究的機(jī)制模型圖

參考文獻(xiàn)：

Ding Lei., Liu Taiyuan., Qu Yuan., Kang Zhichen., Guo Lixin., Zhang Haina., Jiang Junjie., Qu Fuling., Ge Wanbao., Zhang Shanyong.(2021). lncRNA MELTF-AS1 facilitates osteosarcoma metastasis by modulating MMP14 expression. Mol Ther Nucleic Acids, 26(undefined), 787-797. doi:10.1016/j.omtn.2021.08.022