眾所周知，MAPK信號通路和腫瘤進展密切相關，其中MAPK14是該通路上調控結直腸癌（CRC）進展的重要分子模塊。近來，也有不少研究表明circRNA可以編碼多肽，但是circMAPK14是否具有翻譯功能又在CRC中扮演何種作用仍然未知。本研究對此進行了探討，發現CircMAPK14是一個可編碼的腫瘤抑制因子。本文于2021年10月發表在《Clinical and Translational Medicine》IF:11.492期刊上。

技術路線：

主要結果：

1、circMAPK14在CRC細胞和組織中的特征

作者首先從circRNADb數據庫中篩選到了4個來源于MAPK14分子的circRNAs，結果發現只有(hsa_circ_24603在72對CRC組織中顯著上調，將其命名為circMAPK14，其低表達與CRC腫瘤不良預后相關，且在多個CRC細胞系中顯著下調表達。研究顯示circMAPK14來源與MAPK14的外顯子4至10的片段背向剪切而成，全長536nt，并主要定位在細胞質中。

圖1 CRC組織和細胞系中circMAPK14的鑒定和特征

2、circMAPK14抑制CRC的增殖和遷移

接下來作者研究了circMAPK14的生物學功能，如圖2，結果顯示過表達circMAPK14會顯著抑制CRC細胞系的增殖，集落形成，遷移和侵襲，同時促進癌細胞凋亡。

圖2 CircMAPK14抑制CRC細胞的增殖和遷移

3、circMAPK14在CRC中編碼一種新蛋白

基于上述circRNADb數據庫分析，作者發現circMAPK14包含一個開放閱讀框和一個IRES序列，可能編碼一個175個氨基酸的蛋白（命名為circMAPK14-175aa），如圖3A所示。隨后為驗證其編碼蛋白的活性，將IRES的兩個不同區域突變掉（圖3B），發現IRES突變體1顯著降低了熒光素酶活性，但突變體2沒有影響（圖3C）。circMAPK14-175aa多肽序列包含一段MAPK14的同源片段，該片段包含一個特殊的C末端‘Gly Ile Trp’（GIW）序列，并且作者發現了一種針對MAPK14中間段的抗體(aa 150-250)，它能同時識別MAPK14和circMAPK14-175aa。隨后作者進一步探究了circMAPK14-175aa的IRES活性，發現circMAPK14編碼175 aa蛋白，分子量為20 kDa，由IRES序列在核苷酸288-427處驅動（圖3E）。之后將circMAPK14過表達載體和IRES突變體1載體同時轉染至CRC細胞，銀染和LC-MS/MS結果顯示一個特殊序列，FANVFIGANPLGIW，它包含一段C末端有GIW的氨基酸序列，這和前面的研究結果一致，且同樣的結果在WB中也發現了（圖3F-H）。在CRC細胞系和組織中， 這175aa的表達水平都顯著低于對照組，而過表達或敲除這175aa，都不能改變MAPK14的蛋白水平（圖3I-J）。這些結果表明這175個氨基酸是由circMAPK14編碼而來。

圖3 CircMAPK14編碼175個氨基酸的新蛋白質，稱為circMAPK14 -175aa

4、circMAPK14抑制CRC細胞的惡性表型是通過circMAPK14 -175aa

為了進一步評估circMAPK14在CRC中生物學功能是否通過編碼蛋白，作者將以下載體轉染至兩株CRC細胞系中：circMAPK14-ov，circMAPK14 ATG mut，circMAPK14 IRES mut，線性化的175aa-ov，和circMAPK14-sh#1。上述載體都沒有影響MAPK14的表達。結果如圖4所示，circMAPK14-ov和線性化的175aa-ov都能顯著抑制CRC細胞的生物學功能，但是和circMAPK14-ov組相比，circMAPK14 ATG mut，circMAPK14 IRES mut的生物學功能沒有顯著回復，表明circMAPK14抑制CRC細胞的惡性表型是通過circMAPK14 -175aa。

圖4 CircMAPK14體外通過175aa抑制CRC惡性表型

5、circMAPK14緩解腫瘤生成和轉移是通過circMAPK14 -175aa

之后作者進一步在體內探究了circMAPK14 -175aa多肽是否具有生物活性。這里是將circMAPK14-ov和線性化的175aa-ov的細胞系接種至小鼠，結果如圖5所示，這兩種方式都能顯著抑制小鼠的腫瘤體積和重量，以及肺轉移和肝臟轉移。表明circMAPK14編碼的多肽175aa-ov承載了緩解腫瘤生長的生物學功能。

圖5 CircMAPK14在體內通過175aa降低CRC的致瘤性和轉移

6、circMAPK14-175aa抑制MAPK14的磷酸化通過競爭性結合MKK6

為了探究circMAPK14 -175aa調控的潛在機制，作者將Flag-tagged circMAPK14 -175aa轉染至HEK193T細胞，進行免疫沉淀（IP）實驗。作者通過IP裂解物的MS結果鑒定到MKK6蛋白可能與circMAPK14-175aa結合。Flag標記的circMAPK14-175aa可以和MKK6相互作用，并具有細胞質共定位（圖6A-C）。此前有研究表明激活上游激酶MKK6可以磷酸化MAPK14，當MAPK14被磷酸化，它就會被轉移至細胞核從而阻斷FOXC1的降解。由于circMAPK14-175aa和MAPK14共享序列包含其磷酸化識別位點，所以作者猜測circMAPK14-175aa可能可以結合MKK6。因此，進行了co-IP實驗，結果顯示上調circMAPK14增加了circMAPK14-175aa和MKK6的綁定程度，但是降低了MAPK14和MKK6之間的結合（圖6D）。這些結果表明circMAPK14-175aa通過競爭性結合MKK6來抑制MAPK14的磷酸化。

隨后，作者進一步證實改變circMAPK14表達后FOXC1的mRNA和蛋白表達水平，如預期地，FOXC1的蛋白水平隨著circMAPK14表達的改變而改變，但是mRNA水平不受影響（圖6E-F）。作者用蛋白合成抑制劑CHX處理CRC細胞，發現circMAPK14促進FOXC1蛋白的降解，縮短其半周期（圖6G）。為了確定降低circMAPK14的表達是否通過抑制泛素化來維持FOXC1蛋白的穩定性，將Myc-FOXC1和HAUb共轉染到穩定轉染circMAPK14的CRC細胞中，研究發現，過表達circMAPK14可增強FOXC11的泛素化（圖6I）。FOXC1的下游靶基因也發生了相應的變化，包括SOX4、SOX13和MMP10（圖6J）。總的來說，這些數據表明，circMAPK14編碼的circMAPK14-175aa通過抑制MAPK14核易位促進FOXC1降解，而不是直接與FOXC1結合。

圖6 CircMAPK14-175aa通過與MKK6競爭抑制MAPK14的磷酸化，隨后通過泛素化促進FOXC1的降解

總之，本研究表明circMAPK14- 175aa由circMAPK14編碼，依賴于其ORF和IRES序列。circMAPK14- 175aa通過與MKK6競爭性結合抑制MAPK14的磷酸化，從而抑制MAPK14的核轉位。此外，circMAPK14-175aa加速了泛素介導的FOXC1降解，抑制了CRC的進展和轉移。此外，CRC中FOXC1升高是circMAPK14-175aa表達減少所致。反過來，這通過抑制U2AF2的轉錄降低了circMAPK14的循環效率，形成了一個正反饋回路來調節CRC中的circMAPK14（圖7）。

圖7 circMAPK14編碼的circMAPK14-175aa與MKK6競爭抑制CRC的致瘤性和轉移的機制圖

參考文獻：

Wang, L, Zhou, J, Zhang, C, et al. A novel tumour suppressor protein encoded by circMAPK14 inhibits progression and metastasis of colorectal cancer by competitively binding to MKK6. Clin Transl Med. 2021; 11:e613. https://doi-org.washington.80599.net/10.1002/ctm2.613