由于治療抵抗和高復(fù)發(fā)率，膀胱癌治療仍然是一個重大的臨床挑戰(zhàn)。分析腫瘤內(nèi)異質(zhì)性可以揭示膀胱癌復(fù)發(fā)的分子機制。2021年9月發(fā)表于“CLINICAL CANCER RESEARCH”（IF=12.531）的文章“Single-Cell Analyses Reveal Mechanisms of Cancer Stem Cell Maintenance and Epithelial–Mesenchymal Transition in Recurrent Bladder Cancer”對此進行了報道。我們的研究生成了一個由54971個單細胞組成的綜合癌細胞圖譜，并確定了不同的細胞亞群。我們發(fā)現(xiàn)膀胱癌復(fù)發(fā)時腫瘤干細胞亞群豐富，EZH2表達升高。我們進一步定義了一種亞群特異性分子機制，其中EZH2維持H3K27me3介導(dǎo)的NCAM1基因抑制，從而使細胞侵襲性和干細胞轉(zhuǎn)錄程序失活。此外，我們闡明了臨床樣本中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的譜，并揭示了與膀胱癌亞型相關(guān)的不同EMT特征。我們發(fā)現(xiàn)TCF7促進EMT與scATAC-seq分析相一致。我們的研究和分析方法為膀胱癌研究領(lǐng)域中腫瘤干細胞和EMT的進一步研究提供了豐富的資源。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）膀胱癌的單細胞RNA和ATAC-seq

本研究將膀胱癌患者分為低危組、高危組和復(fù)發(fā)組(圖1A)。根據(jù)美國泌尿外科協(xié)會(AUA)/泌尿腫瘤學協(xié)會(SUO)指南對低危和高危NMIBC進行分層，并將MIBC樣本分為高危組。在去除低質(zhì)量的細胞后，我們總共獲得了37000個用于scRNA-seq的細胞(圖1B和C)和17571個用于scATAC-seq的細胞(圖1D-F)。我們整合了低風險、高風險和復(fù)發(fā)性膀胱癌的數(shù)據(jù)，并通過檢測標記基因確定了scRNA-seq中的主要細胞群。我們還確定了scATAC-seq數(shù)據(jù)中的主要細胞亞群，并觀察到標記基因的開放染色質(zhì)（圖1E）。scRNA-seq和ATAC-seq檢索到的大多數(shù)細胞是非免疫細胞（圖1C和F）。與低風險和復(fù)發(fā)性膀胱癌相比，我們通過scRNA-seq和scATAC-seq在高風險膀胱癌中檢測到更多的免疫細胞（圖1F）。我們在scATAC-seq數(shù)據(jù)中觀察到的免疫細胞組分少于scRNA-seq數(shù)據(jù)（圖1C和F）。

2）膀胱癌非免疫細胞的高度異質(zhì)性

我們首先根據(jù)簇特異性DE基因?qū)⒎敲庖呒毎?/span>CD45陰性）重新分類為17個簇（圖2A和B）。在所有簇中，鑒定出9個基底細胞簇（簇0、2、3、5、8、10、13、14），高度表達角蛋白基因，如KRT5、KRT13、KRT17和KRT19。簇1、6、9和15被指定為表達UPK3A、UPK1A、UPK2、UPK1B、UPK3B和EPCAM的上皮細胞。聚類11中血管內(nèi)皮細胞富集，高表達CDH5和PECAM1。成纖維細胞(簇4、7、12和16)高表達膠原基因，如COL1A1、COL1A2和COL3A1。最近，據(jù)報道，胰腺癌和膀胱癌中的成纖維細胞分為兩種不同類型，其中一種表現(xiàn)出多種細胞因子和趨化因子的強烈表達[稱為“炎性癌相關(guān)成纖維細胞（iCAF）]，另一種類似于肌成纖維細胞（mCAF）。我們對成纖維細胞進行了重新分類，發(fā)現(xiàn)表達RGS5的iCAF和表達PDGFRA的mCAF也存在于膀胱癌中（圖2C和D）。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)這些iCAF和mCAF不是腫瘤特異性的，也可以在健康組織中檢測到（圖2D）。在注釋了膀胱癌的細胞亞型后，我們接下來評估了這些膀胱癌細胞類型是否能夠反映一致的分子分類。我們將單個細胞的轉(zhuǎn)錄組與1750名患者的MIBC轉(zhuǎn)錄組進行比較，發(fā)現(xiàn)管腔乳頭狀、管腔非特異性、管腔不穩(wěn)定、基質(zhì)豐富和基底/鱗狀亞型與我們數(shù)據(jù)集的細胞類型相對應(yīng)（圖2E）。當將TCGA細胞分數(shù)數(shù)據(jù)與一致的分子亞型相關(guān)聯(lián)時，我們注意到TCGA/BCLA隊列可以重現(xiàn)我們的scRNA序列數(shù)據(jù)中確定的細胞類型（圖2F）。

3）scRNA-seq顯示復(fù)發(fā)性膀胱癌中豐富的異質(zhì)性CSC亞群

我們接下來檢查了膀胱癌干細胞（BCSC）標記物CD44和ALDH1A1的表達，發(fā)現(xiàn)它們在基底細胞簇2和5中富集，表明BCSC可能來源于基底細胞。這些細胞的重新聚集產(chǎn)生了8個亞群（圖3A）。與健康、低風險和高風險人群相比，復(fù)發(fā)性膀胱癌亞群0、2、6和8更為豐富（圖3B）。BCSCs的調(diào)控可分為兩組，其中一組被CHD2、SIN3A、YY1和KDM5B富集（圖3C）。KDM5B是組蛋白H3K4me3的去甲基化酶，在包括膀胱癌在內(nèi)的多種人類癌癥中都有過表達的報道。此外，KDM5B的磷酸化可能調(diào)節(jié)其在乳腺癌中的活性。另一組BCSC調(diào)控子包括SOX15、ATF3、KLF10和EZH2（圖3C）。EZH2催化H3K27me3，從而抑制靶基因表達，EZH2的高表達也與膀胱癌的進展有關(guān)。因此，我們假設(shè)EZH2在BCSCs中起關(guān)鍵作用，從而促進膀胱癌復(fù)發(fā)。

為了深入了解EZH2和H3K27甲基化在膀胱癌中的作用，我們在膀胱癌細胞系中使用shRNA構(gòu)建了兩種不同的shRNA構(gòu)建物，構(gòu)建了2個獨立穩(wěn)定的EZH2敲除（KD）細胞系（圖3D）。值得注意的是，與野生型（WT）細胞相比，EZH2 KD細胞的增殖、集落形成和遷移能力受損（圖3E-H）。此外，將EZH2 KD細胞移植到裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤比WT細胞更?。▓D4A和B）。與shRNA對照異種移植物相比，EZH2 KD異種移植物減少了細胞增殖標記物Ki67染色，但增加了細胞死亡標記物TUNEL染色（圖4C-E）?？傊?，EZH2在尿路上皮癌細胞的干細胞獲得中起著關(guān)鍵作用。

4）EZH2塑造膀胱癌細胞粘附和干細胞基因的表觀遺傳景觀

我們進行了CUT&Tag檢測和ATAC-seq檢測WT和EZH2 KD細胞中的H3K27me3, H3K27ac和可訪問染色質(zhì)(圖5A)。EZH2的耗盡導(dǎo)致68%的H3K27me3峰的損失，這與其H3K27me3的催化活性相一致(圖5A)。此外，EZH2的KD增加了55%的H3K27ac峰，而EZH2缺失時，可接近的染色質(zhì)峰增加了29%。總體而言，EZH2的缺失與H3K27ac的顯著增加和開放染色質(zhì)的輕微增加是一致的，這是活性基因轉(zhuǎn)錄的標記(圖5A)。

接下來，我們確定了EZH2 KD細胞中易接近染色質(zhì)的相關(guān)功能。我們將可接近的染色質(zhì)峰分為WT特異性、一致性和EZH2特異性峰（圖5B）。與這些峰值相關(guān)的GO注釋表明，它們與細胞粘附、EGFR信號通路、干細胞分化和組織重塑有關(guān)（圖5B）。為了確定膀胱癌中EZH2調(diào)節(jié)的TFs，我們進行DNA足跡分析。我們在EZH2耗盡后觀察到一些差異有統(tǒng)計學意義的TFs，如TCF4、TCFL5、CEBPB等，提示EZH2可能通過這些因子調(diào)控細胞的干性（圖5C）。

為了進一步了解EZH2在膀胱癌復(fù)發(fā)中的機制，我們進行了RNA-seq，發(fā)現(xiàn)EZH2缺失后，大量據(jù)報道維持癌細胞干細胞的粘蛋白基因被下調(diào)（圖5D），表明EZH2可能通過粘蛋白基因維持癌細胞干細胞。此外，EZH2的缺失導(dǎo)致NCAM1的表達顯著增加。EZH2缺失后，NCAM1啟動子和基因體中的H3K27me3水平顯著降低，表明EZH2對該基因的直接調(diào)控（圖5E）?？傊珽ZH2的KD減弱干細胞基因的表達，并直接激活NCAM1轉(zhuǎn)錄，促進膀胱癌細胞的細胞粘附。

5）膀胱癌具有明顯的EMT特征

非免疫細胞簇1、6、9和15為上皮細胞(圖2A)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學，我們將這些細胞分為風險低、風險高和復(fù)發(fā)性膀胱癌亞型，以計算重建假時間路徑(圖6A)。我們在每個條件下鑒定了具有偽時間路徑的共表達基因，發(fā)現(xiàn)幾個誘發(fā)EMT的轉(zhuǎn)錄因子，如TCF3、TCF4、TWIST1、SNAI1和FOXC2，都與EMT軌跡相關(guān)(圖6B)。這些誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子可以直接或間接結(jié)合E-cadherin啟動子，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進EMT。有趣的是，TCF7的表達模式與誘導(dǎo)EMT的TFs相似(圖6B)。為了進一步了解TF在EMT中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，我們分析了上皮細胞的scATAC-seq數(shù)據(jù)，確定了7個亞群(圖6C)。各亞群的DNA足跡顯示，TCF7基序在0 ~ 3亞群中與其他誘導(dǎo)EMT的TFs一起富集，提示TCF7可能與SNAI1/2、TCF3/4、ZEB1等其他誘導(dǎo)EMT的TFs調(diào)控和誘導(dǎo)EMT的方式相同(圖6 D)。

為了驗證TCF7在膀胱癌中的功能，我們在膀胱癌細胞中使用shRNA介導(dǎo)的TCF7 KD（圖7A）。TCF7的缺失導(dǎo)致細胞遷移和侵襲能力受損（圖7B和C），表明TCF7 KD減弱了這些細胞中的EMT。為了深入了解TCF7在EMT中的功能，我們在TCF7 KD細胞中進行了大量RNA測序。GO富集分析表明TCF7靶基因與EMT標志基因相關(guān)（圖7D）。與TCF7在EMT中的作用一致，清除TCF7可阻斷裸鼠腫瘤的生長(圖7E)。TCF7 KD腫瘤在體內(nèi)表現(xiàn)出細胞增殖受損和凋亡細胞死亡增強（圖7F-H）。總之，這些結(jié)果表明TCF7可以啟動EMT并促進腫瘤生長。

結(jié)論：我們使用scRNA-seq進行轉(zhuǎn)錄組分析，使用scATAC進行染色質(zhì)染色質(zhì)景觀分析，并生成了一個包含50000多個膀胱癌細胞的大型數(shù)據(jù)集，這些細胞來自13名膀胱癌患者，分為低風險、高風險和復(fù)發(fā)組?；谶@個大數(shù)據(jù)集，我們描述了EZH2在CSC亞群中的功能，以及TCF7在EMT中的功能。我們相信我們的研究和分析方法為CSCs和EMT在膀胱癌研究領(lǐng)域的進一步研究提供了豐富的資源。

參考文獻：Wang H, Mei Y, Luo C, et al. Single-Cell Analyses Reveal Mechanisms of Cancer Stem Cell Maintenance and Epithelial–Mesenchymal Transition in Recurrent Bladder Cancer[J]. Clinical Cancer Research, 2021. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-4796