選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)如他莫昔芬已被證明對雌激素受體(ER)陽性乳腺癌有效。然而，這種內(nèi)分泌治療的主要障礙是雌激素獨立生長，導(dǎo)致耐藥性，其潛在機制尚不完全清楚。目前，有研究對長鏈非編碼RNA (lncRNA)是否參與ER陽性乳腺癌中雌激素獨立生長和他莫西芬耐藥的調(diào)控進行了研究，該研究于2021年10月發(fā)表在《Cell Death & Disease》，IF:8.469。

主要技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. Lnc-DC被鑒定為參與雌激素獨立生長的潛在lncRNA；它的上調(diào)與乳腺癌患者的生存和他莫西芬反應(yīng)有關(guān)。

作者首先對參與雌激素非依賴性生長的lncRNA進行功能篩選。使用圖中概述的選擇程序圖1A，發(fā)現(xiàn)在雌激素剝奪28天后，用于載體控制的存活細胞很少，而用于SAM gRNA文庫的存活細胞更多，這表明可以促進細胞在無E2培養(yǎng)基中存活的SAM gRNA被富集。由于雌激素非依賴性常常導(dǎo)致三苯氧胺抵抗，因此這個過程是否會影響這些細胞對三苯氧胺的反應(yīng)。正如所料，選擇后(As)細胞比選擇前(BS)細胞對他莫昔芬更具耐藥性(圖1B)。與這些結(jié)果一致的是，TUNEL檢測顯示，AS細胞在三苯氧胺作用下的凋亡率(~8%)遠低于BS細胞(~20%)(圖1C)。接下來，將BS細胞或AS細胞注射到雌性裸鼠的乳腺脂肪墊中，以確定它們是否可以在不補充雌激素的情況下生長成腫瘤。正如預(yù)期的那樣，添加E2(雌二醇顆粒)的親代MCF-7導(dǎo)致100%的腫瘤發(fā)生率(圖1D)。不含E2的BS細胞腫瘤率為17%；相比之下，不含E2的AS細胞腫瘤攝取率為35%(圖1D)，進一步表明lncRNA參與促進雌激素獨立生長。為了確定哪些SAM gRNAs被這種選擇富集，作者采用了兩步方法。第一步是對該文庫中的每個lncRNA進行qRT-PCR序列分析。第二步是利用gRNA特異性引物集，通過qRT-PCR檢測SAM gRNA的相對豐度，重點檢測雌激素剝奪后富集的SAM gRNA。lncRNA分析發(fā)現(xiàn)，與選擇前(BS)相比，選擇后(AS)有3個lncRNA (C1qTNF9B-AS1, Lnc-DC和MEG3)表達上調(diào)(圖1E)。基于乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)Lnc-DC和MEG3都在數(shù)據(jù)庫中。有趣的是，在1764例乳腺癌病例中，Lnc-DC上調(diào)與無復(fù)發(fā)生存期(RFS)較差相關(guān)，Logrank為4.6e-0.5, HR = 1.39(圖1F)。高Lnc-DC水平與低RFS相關(guān)，Logrank為0.01,HR = 4.4(圖1G)。該分析也支持了Lnc-DC水平高的患者對他莫昔芬反應(yīng)較差的觀點(圖1H)，提示了Lnc-DC的臨床重要性。因此，我們進一步對Lnc-DC進行了表征，用于后續(xù)實驗。

圖1 Lnc-DC作為一種潛在的lncRNA參與雌激素獨立和他莫西芬耐藥。

2. Lnc-DC促進他莫昔芬耐藥

為了證實Lnc-DC gRNA對上調(diào)Lnc-DC表達的作用，從gRNA區(qū)域和支架區(qū)域設(shè)計了引物來檢測外源性的Lnc-DC gRNA水平。雖然該SAM文庫中包含5種不同的Lnc-DC gRNA，但選擇后只有Lnc-DC gRNA 1 (Lnc-DC1)高度富集(圖2A)。另外，只有LncDC1能夠激活內(nèi)源性的Lnc-DC表達(圖2B)，這表明雖然不是所有的gRNA都能誘導(dǎo)內(nèi)源性基因表達，但那些能夠誘導(dǎo)內(nèi)源性基因表達的gRNA可以通過雌激素剝奪等選擇手段富集。接下來，作者確定了Lnc-DC對他莫昔芬耐藥的貢獻。用它莫西芬處理Lnc-DC1細胞和載體對照細胞。如圖2C所示，Lnc-DC1細胞對他莫昔芬的抗性是載體對照細胞的3倍。同樣，Lnc-DC1導(dǎo)致的凋亡率低于載體對照(圖2D)。此外，Lnc-DC1細胞顯示Bcl2和Bcl-xL水平升高(圖2E)，這可能是觀察到的對他莫昔芬耐藥的部分原因。Lnc-DC也降低了PARP和Caspase 3的裂解水平(圖2F)。通過TUNEL實驗可以明顯看出，Lnc-DC KO細胞對他莫昔芬更敏感(圖3A)。然后，作者選擇了兩個單一的Lnc-DC KO克隆，同時納入了另一個ER陽性乳腺癌細胞系T47D(圖S4)。菌落形成分析顯示，在MCF-7細胞中，兩個Lnc-DC KO克隆對他莫昔芬更敏感(圖3B)。例如，MCF-7 Lnc-DC KO的IC50為11.6 (KO#17)和12.92 (KO#66)，而病媒控制(IC50為21.3)。與載體對照相比，Lnc-DC KO T47D細胞對他莫昔芬也更敏感(圖3C)。為了進一步確定Lnc-DC在他莫昔芬耐藥中的作用，作者進行了搶救實驗。在MCF-7和T47D細胞中，發(fā)現(xiàn)Lnc-DC KO增加了對他莫昔芬的敏感性；相比之下，在KO細胞中Lnc-DC的重新表達恢復(fù)了作為載體對照的他莫昔芬應(yīng)答(圖3D, E)。總之，這些結(jié)果支持了LncDC在他莫昔芬耐藥中的作用。

圖2 Lnc-DC促進他莫昔芬耐藥

圖3用Lnc-DC KO法和搶救法測定Lnc-DC介導(dǎo)的他莫昔芬耐藥性。

3. Lnc-DC促進STAT3磷酸化

為了確定Lnc-DC如何促進他莫昔芬耐藥，作者檢測了這些細胞中STAT3的磷酸化。首先在選擇前檢測了攜帶SAM gRNA庫的細胞中STAT3的磷酸化，發(fā)現(xiàn)載體細胞和庫細胞之間沒有差異(圖4A)。然而，在選擇后，庫細胞比BS細胞顯示更高水平的磷酸化STAT3(圖4B)。為了確定Lnc-DC在STAT3激活中的作用，作者過表達了Lnc-DC，發(fā)現(xiàn)LncDC1能夠增加pSTAT3^Y705在正常和E2游離培養(yǎng)基中的水平(圖4C)。此外，Lnc-DC KO導(dǎo)致pSTAT3^Y705水平下降(圖4D)。STAT3抗體RNA免疫沉淀實驗證實Lnc-DC與STAT3相互作用(圖4E)。此外，在S1m-LNC-DC沉淀中檢測到一個STAT3帶。這些結(jié)果有力地支持了Lnc-DC和STAT3之間的相互作用是特定的。為了確定Lnc-DC如何影響STAT3活性，作者發(fā)現(xiàn)雌激素剝奪降低了STAT3與SHP-1的相互作用(圖4G)， 而SHP-1是一種參與調(diào)控STAT3活性的磷酸酶。重要的是，Lnc-DC降低了SHP-1與STAT3之間的相互作用(圖4H)，這可能部分解釋了當(dāng)Lnc-DC水平升高時，STAT3活性升高的原因。

圖4 Lnc-DC通過與STAT3相互作用促進STAT3活性

4. 他莫昔芬耐藥AS細胞分泌的細胞因子激活STAT3

與載體對照相比，在AS細胞的條件培養(yǎng)基中觀察到pSTAT3^Y705的明顯激活(圖5A)，表明細胞因子分泌到培養(yǎng)基中，能夠激活相鄰細胞的STAT3。為了確定從AS細胞培養(yǎng)中分泌的細胞因子，通過攜帶102種細胞因子抗體的細胞因子陣列從條件培養(yǎng)基中進行細胞因子分析。事實上，有一組11種細胞因子在AS細胞來源的培養(yǎng)基中比在載體對照細胞中更高(圖5B)。qRT-PCR分析驗證了其中5個(GDF15、IGFBP-2 PDFG-A、CXCL12和VEGF)(圖5C為綠色)，與載體對照相比，它們在AS細胞中也上調(diào)(圖5D)。qRT-PCR分析顯示，這5個細胞因子基因中有4個在STAT3 KD細胞中明顯下調(diào)(圖5E)。特別是GDF15的抑制最為明顯。最后，與對照組相比，用GDF15、IGFBP-2和VEGF處理MCF-7細胞可增強pSTAT3^Y705的磷酸化(圖5F)。這些結(jié)果提示STAT3和細胞因子存在一個正反饋回路，它們共同促進他莫昔芬耐藥。

圖5 STAT3介導(dǎo)的細胞因子的產(chǎn)生

5. Lnc-DC通過STAT3促進細胞因子的產(chǎn)生

通過qRT-PCR證實了Lnc-DC1細胞中三個細胞因子基因中的兩個被轉(zhuǎn)錄激活(圖6A)。還發(fā)現(xiàn)這兩種細胞因子的蛋白質(zhì)水平升高(圖6B)。此外，在Lnc-DC細胞中通過siRNA下調(diào)STAT3，發(fā)現(xiàn)STAT3 KD能夠抑制GDF15和IGFBP2(圖6C)。此外，Lnc-DC KO下調(diào)GDF15 mRNA水平(圖6D)和蛋白水平(圖6E)。特別是， GDF15在GDF15轉(zhuǎn)錄起始位點上游約600 bp處攜帶一個典型的STAT3結(jié)合位點(圖6F)。STAT3抗體ChIP分析證實STAT3與GDF15啟動子相互作用(圖6F)。針對GDF15啟動子的PCR引物僅在STAT3抗體通道中檢測到一條獨特的PCR帶，而IgG或Ku80抗體(陰性對照)通道中檢測不到?？傊?，這些結(jié)果表明，在Lnc-DC起關(guān)鍵作用的地方存在STAT3-細胞因子循環(huán)。結(jié)果，這些細胞變得獨立于雌激素，并對它莫西芬產(chǎn)生抗藥性(圖6G)。

圖6 Lnc-DC促進細胞因子基因的表達

主要結(jié)論：

綜上所述，作者證明了Lnc-DC在STAT3細胞因子環(huán)路的調(diào)控中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，導(dǎo)致雌激素獨立和他莫西芬耐藥。此外，臨床數(shù)據(jù)挖掘表明，Lnc-DC可能作為預(yù)測他莫昔芬反應(yīng)的潛在標(biāo)志物。在這個調(diào)節(jié)系統(tǒng)中，JAK促進STAT3磷酸化，而SHP-1促進去磷酸化。Lnc-DC與STAT3的相互作用可能阻止SHP-1對pSTAT3的作用，保持較高的pSTAT3水平。STAT3已知能夠上調(diào)抗凋亡基因，并刺激細胞因子的產(chǎn)生。由于CXCL12、IGFBP2和GDF15等細胞因子可同時受ER和STAT3調(diào)控，可以想象這些細胞因子除了抗凋亡基因外，可以在升高的Lnc-DC背景下持續(xù)產(chǎn)生，即使通過雌激素剝奪或三苯氧胺治療等臨床干預(yù)手段關(guān)閉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號，這些腫瘤細胞仍能存活和生長。該研究為臨床研究他莫昔芬耐藥提供新的思路。