具有淋巴結（LN）的前列腺癌（BCa）患者的預后更差。BCa來源外泌體可作為循環生物活性載體以介導腫瘤微環境中的信號轉導進而觸發腫瘤轉移。本研究揭示了一個新的機制，即外泌體BCYRN1協同增強VEGF-C/VEGFR3信號通路誘導LN轉移。本文于2021年6月發表在《Clinical and Translational Medicine》 IF:11.492期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、外泌體BCYRN1與BCa淋巴結轉移相關

首先作者對患者的尿來源的外泌體進行高通量測序，發現255個lncRNA上調表達，然后分析外泌體lncRNA與VEGF-C/VEGFR3信號激活的相關性，發現BCYRN1，MAP4K3-DT和RP5-857K21.7與其顯著正相關，擴大臨床樣本驗證后發現只有BCYRN1在BCa患者尿液外泌體中高表達（圖1A-1D）。FISH和亞細胞定位顯示BCYRN1主要存在于細胞質中。此外，臨床驗證的結果顯示BCYRN1在BCa組織的表達顯著高于癌旁，在LN轉移的腫瘤組織中表達水平顯著高于無LN轉移的，且其高表達與不良預后相關（圖1G-1K）。免疫組化分析顯示淋巴管內皮透明質酸受體1 (LYVE-1)陽性信號的結果顯示，BCa組織瘤周和瘤內區域BCYRN1表達與微淋巴管密度呈正相關（圖1M-1N）。以上說明外泌體BCYRN1促進BCa淋巴結轉移并與不良預后相關。

圖1外泌體BCYRN1過表達與BCa淋巴結轉移相關

2、BCYRN1在BCa細胞分泌的外泌體中高表達

隨后，在體外檢測外泌體BCYRN1的表達模式，和體內結果一致，與對照組細胞相比，BCYRN1在BCa細胞分泌的外泌體中高表達。BCYRN1過表達和干擾實驗的結果顯示，過表達BCYRN1促進HLECs的淋巴管生成和遷移，干擾BCYRN1的表達則相反。表明外泌體BCYRN1促進體外BCa的惡性表型。

圖2外泌體BCYRN1促進體外BCa的淋巴管生成

此外，體內實驗顯示，過表達外泌體BCYRN1顯著增強原癌腫瘤的LN轉移（圖3B-3C），并且增大了LN的轉移體積和比例（圖3D-3G）。 提示，外泌體BCYRN1促進體內BCa的LN轉移。

圖3外泌體BCYRN1在體內增強BCa的LN轉移

3、BCYRN1直接與hnRNPA1相互作用

從lncRNA和蛋白相互作用的角度出發，作者使用pull-down實驗鑒定了與BCYRN1相互作用的候選蛋白質（圖4A-4C），然后使用WB證實BCYRN1與hnRNPA1之間存在相互作用（圖4D-4E）。共聚焦實驗表明兩者存在共定位表達，RIP表明與對照相比，BCYRN1顯著富集于hnRNPA1探針中，這進一步證實了兩者的結合關系。序列敲除后的WB表明BCYRN1與hnRNPA1的結合依賴50–100-nt區域，如圖4I所示區域?？傊珺CYRN1通過50-100nt區域直接與hnRNPA1結合。

圖4 BCYRN1直接與hnRNPA1相互作用

4、BCYRN1上調WNT5A的表達通過與其啟動子形成DNA-RNA復合物

鑒于許多證據表明lncRNA廣泛參與腫瘤進展的細胞內信號調節，所以作者檢測了BCa細胞中過表達或沉默BCYRN1后終于信號相關基因的表達變化。結果顯示WNT5A是最顯著改變的基因，且其表達與BCYRN1表現出相關性（圖5A）。熒光素酶實驗顯示包含有-500至-700bp的WNT5A啟動子的片段可以顯著增加BCYRN1過表達細胞的熒光素酶活性（圖5B）。ChIRP實驗顯示BCYRN1直接與WNT5A啟動子的-661至671bp區域結合。FRET實驗顯示與單鏈RNA/WNT5A TTS3對照組相比，在BCYRN1 TFO3/WNT5A TTS3組的信號強度在570-580nm出顯著增強，在520nm處顯著減弱（圖5E-5G）。

作者此前的研究證實hnRNPA1誘導的H3K4me3在基因表達中發揮了重要作用，所以作者猜測BCYRN1是否通過增加hnrnpa1誘導的WNT5A啟動子上的H3K4me3來介導WNT5A的轉錄激活。ChIP-qPCR證實了該猜想，BCYRN1沉默顯著降低了WNT5A啟動子中hnRNPA1和H3K4me3的富集程度，而BCYRN1過表達顯著增加了BCa中hnRNPA1和H3K4me3在WNT5A啟動子中的富集（圖5H-5I）。因此，以上表明BCYRN1通過與WNT5A啟動子結合，形成DNA-RNA結構，招募hnRNPA1增加其H3K4me3水平，激活WNT5A轉錄。

5、BCYRN1激活Wnt/β-catenin信號通路，促進VEGF-C的分泌

隨后，作者發現沉默或過表達BCYRN1會相對應的抑制或激活Wnt/β-catenin信號通路，如圖5J-5M所示，并且也會相對應的減少或增加VEGF-C分泌，如圖5N-5Q。總之，BCYRN1能激活Wnt/β-catenin信號通路促進VEGF-C分泌。

圖5 BCYRN1表觀遺傳學上調WNT5A表達，激活Wnt/β-catenin通路，促進BCa細胞VEGF-C分泌

6、外泌體BCYRN1被HLECs內化，促進BCa的淋巴管生成

研究發現外泌體BCYRN1可以被HLECs內化，過表達或沉默BCYRN1可以增加或減少受體HLECs中BCYRN1的表達（圖6A-6F）。隨后構建了BCYRN1敲除的HLECs細胞系，然后在敲除組和野生組過表達BCYRN1，結果發現無論敲除組還是對照組，過表達BCYRN1的外泌體處理都會顯著增加細胞tube的長度，遷移數量，而敲除后沉默BCYRN1則相反（圖6G-6L）。這些結果表明，外泌體BCYRN1可以被HLECs內化，進而促進BCa的淋巴管生成。

圖6外泌體BCYRN1被傳遞到HLECs促進BCa的淋巴管生成

7、外泌體BCYRN1與hnRNPA1/WNT5A/VEGFR3調節軸形成前饋回路

用BCYRN1沉默外泌體孵育HLECs后，其VEGFR3的表達顯著下降，過表達則相反（圖7A-7D）。生物素化寡核苷酸的RNA下拉實驗表明，外泌體BCYRN1與VEGFR3的3 -UTR直接相互作用，而誘導VEGFR3的3 -UTR的潛在結合位點突變，則削弱了其與外泌體BCYRN1的相互作用（圖7F-7K）。由于與mRNA的3-UTR的相互作用是有助于細胞中的RNA穩定性的一個共同特征，作者進一步進行放線菌素D檢測，揭示由BCYRN1沉默的BCa細胞分泌的外泌體顯著縮短了VEGFR3 mRNA的半衰期，而過表達BCYRN1的BCa細胞的外泌體延長了VEGFR3 mRNA的半衰期（圖7L-7O）。提示外泌體BCYRN1促進了HLECs中VEGFR3 mRNA的穩定性。預測的BCYRN1的二級結構如圖7P所示，包含與VEGFR3的3’-UTR結合的一個莖環結構。突變該區域則顯著廢止了延長VEGFR3 mRNA的半衰期的能力（圖7Q-7R）?？傊?，研究表明，外泌體BCYRN1通過與VEGFR3的3’ -UTR相互作用，促進VEGFR3 mRNA在HLECs中的穩定性，從而構成一個與hnRNPA1/WNT5A/VEGFR3調節軸相連的前反饋回路。

圖7外泌體BCYRN1通過增強VEGFR3 mRNA在HLECs中的穩定性上調VEGFR3的表達

8、前饋環路誘導的VEGF-C/VEGFR3信號對于外泌體BCYRN1介導的LN轉移至關重要

接下來，作者探討了抑制前導環路誘導的VEGF-C/VEGFR3信號是否會減弱外泌體BCYRN1誘導BCa淋巴管生成和LN轉移的促進作用。挽救實驗結果如圖8所示，與BCYRN1過表達BCa分泌外泌體孵育會促進HLECs的成管和遷移，但是這被沉默VEGFR3所廢除（圖8A）。此外，作者引入了阻斷VEGFR3活性的抑制劑，SAR131675，結果發現，經SAR131675處理后，外泌體BCYRN1誘導的裸鼠淋巴結熒光強度增強明顯受損（圖8B）。WNT5A和VEGFR3的表達在上述各處理下的變化模式也和上述一致（圖8C-8F），提示阻斷VEGFR3可抑制外泌體BCYRN1介導的BCa體內淋巴管生成。此外，圖8G-8I的結果表明，BCYRN1外泌體與BCa患者淋巴結轉移顯著相關。綜上所述，這些發現表明前導環路誘導的VEGF-C/VEGFR3信號通路對于BCYRN1介導的BCa淋巴管生成和LN轉移是必不可少的。

圖8前饋環路誘導的VEGF-C/VEGFR3信號對于BCa的外泌體BCYRN1介導的LN轉移至關重要

總之，如圖8J所示，該研究結果強調了外泌體BCYRN1通過形成一個與hnRNPA1/WNT5A/VEGFR3調節軸相關的前反饋回路在BCa淋巴管生成和LN轉移中的重要作用。外泌體BCYRN1通過VEGFC依賴方式介導BCa LN轉移的分子機制，為外泌體lncRNA誘導腫瘤淋巴轉移提供了新的思路。靶向外泌體BCYRN1阻斷VEGF-C/VEGFR3信號的病理過度激活是一種很有前景的LN轉移性BCa患者的臨床干預手段。

參考文獻：

Zheng Hanhao., Chen Changhao., Luo Yuming., Yu Min., He Wang., An Mingjie., Gao Bowen., Kong Yao., Ya Yiyao., Lin Yan., Li Yuting., Xie Keji., Huang Jian., Lin Tianxin.(2021). Tumor-derived exosomal BCYRN1 activates WNT5A/VEGF-C/VEGFR3 feedforward loop to drive lymphatic metastasis of bladder cancer. Clin Transl Med, 11(7), e497. doi:10.1002/ctm2.497