輸尿管梗阻引起的腎積水與腎纖維化和進行性慢性腎病(CKD)有關。外泌體介導的細胞-細胞通訊被認為與各種疾病有關，包括腎纖維化。然而，對于外泌體如何調節梗阻腎臟的腎纖維化知之甚少。2021年8月發表于Theranostics（IF=11.556）的文章“Exosomal miR-21 from tubular cells contributes to renal fibrosis by activating fibroblasts via targeting PTEN in obstructed kidneys“對此進行了介紹。研究發現腎纖維化的增加與單側輸尿管梗阻(UUO)的延長天數有關，外泌體分泌在UUO腎和TGF-β1刺激的NRK-52E細胞中顯著增加。從TGF-β1刺激的NRK-52E細胞中純化的外泌體可激活成纖維細胞并加重腎纖維化。此外，Rab27a敲除或GW4869處理抑制外泌體分泌可消除成纖維細胞激活，改善腎纖維化。TGFβ1-Exos中外泌體miR-21較Ctrl-Exos明顯升高，且PTEN是miR-21的靶點。在體外，上皮外泌體miR-21的促進或抑制相應地加速或消除成纖維細胞的激活，而在體內，miR-21缺陷的外泌體通過PTEN/Akt途徑緩解UUO后腎纖維化。我們的研究結果表明，來自腎小管上皮細胞的外泌體miR-21可能通過miR-21/PTEN/Akt通路激活成纖維細胞，從而加速腎纖維化的發展。

技術路線

結果

1）UUO誘導的腎纖維化模型中TGF-β1的表達和外泌體的產生增加

我們首先通過Masson三色染色、Sirius紅染色、western blotting和免疫組化方法評估UUO-3d和UUO-7d模型腎纖維化和TGF-β1的表達(圖1A-H)。結果提示，TGF-β1表達和腎纖維化與梗阻天數呈正相關。為了進一步闡明外泌體是否在UUO模型中發揮作用，我們進行了透射電鏡、免疫熒光和western blotting檢測。透射電鏡顯示UUO后細胞外囊泡分泌明顯增加。此外，許多細胞外囊泡的外泌體直徑為30-150 nm(圖1I)。CD63和TSG101(外泌體標記物)的Western blot(圖1G和H)和免疫染色(圖1J-L)顯示，外泌體在UUO-3d組中明顯增加，在UUO-7d組中進一步增加。此外，外泌體主要分布在腎小管上皮周圍(圖1J)。

2）TGF-β1促進腎小管上皮細胞分泌外泌體，并在體外激活成纖維細胞

我們研究了腎小管來源的外泌體在介導成纖維細胞激活中的潛在作用。TGF-β1作為主要的成纖維因子，用于刺激UUO腎損傷/應激小管細胞的狀態。不同濃度TGF-β1伴或不伴GW4869孵育24小時后，NRK-52E細胞與無外泌體培養基孵育24小時，從條件培養基中收集外泌體來刺激正常大鼠腎間質成纖維細胞(NRK-49F細胞)(圖2A)。如圖2B-D所示，NTA、DLS和TEM顯示大部分分離的細胞外囊泡為外泌體。CD63的Western blot分析證實，外泌體的分泌依賴于TGF-β1的濃度，而GW4869處理明顯抑制了細胞外基質的沉積(圖2E-F)。隨后我們用PKH-67標記NRK-52E細胞，熒光強度顯著增強，進一步證實TGF-β1處理后外泌體分泌增加(圖2G)。此外，PKH-67標記的外泌體與NRK-49F細胞孵育后被成纖維細胞吸收(圖2H)。從TGF-β1處理的NRK-52E細胞中分離的外泌體能夠誘導NRK-49F細胞增殖和基質生成，表現為α-SMA、PCNA、Col-I和纖連蛋白表達增加。而GW4869處理明顯逆轉了上述變化(圖2I-N)。

3）腎小管細胞來源的外泌體促進體內腎纖維化

為了研究腎小管來源的外泌體與UUO誘導的纖維化在體內的相關性，我們使用UUO模型進行了動物研究，注射從TGF-β1處理的NRK-52E細胞中分離出來的TGFβ1-exos。實驗設計如圖3A所示。如圖3B所示，在體內，我們觀察到NRK-52E細胞PKH-67標記的TGFβ1-Exos存在于梗阻的腎臟中。此外，與Ctrl-Exo相比，注射TGFβ1-Exo可以明顯誘導CD63和TSG101的表達(圖3C-D)。然后我們檢測了外泌體注射對UUO腎臟的影響。如圖3E-L所示，與Ctrl-Exos相比，TGFβ1-Exos促進了UUO后7天阻塞腎臟中成纖維細胞的增殖，并加劇了纖維連接蛋白和膠原沉積。

4）Rab27a敲除可抑制外泌體分泌，減輕UUO誘導的體內腎纖維化

如圖4A-C所示，成功構建并證實了Rab27a敲除小鼠(Rab27a-/-)。western blot檢測CD63的表達，表明敲除Rab27a可減少UUO腎臟的外泌體分泌(圖4D-E)。接下來我們檢查了成纖維細胞的激活和纖維連接蛋白和膠原的沉積。western blotting(圖4F, I)和免疫熒光(圖4F, H, J)檢測證實了敲除Rab27a明顯抑制了成纖維細胞的激活。同時，Masson染色，Col-I免疫組化染色和纖維連接蛋白免疫熒光染色證實，敲除Rab27a可通過抑制膠原蛋白和纖維連接蛋白沉積而改善UUO后腎纖維化(圖4G, K-M)。

5）腎小管細胞來源的外泌體miR-21促進體外成纖維細胞活化

為了探究管狀細胞來源的外泌體miRNA是否發揮作用，我們進行了miRNA測序(圖5A)。在所有改變的miRNA中，miR-21的升高最為顯著，我們進一步證實，TGF-β1處理后，miR-21在NRK-52E細胞和NRK-52E傳遞的外泌體中被誘導(圖5D)。為了證實外泌體miR-21的作用，我們將miR-21模擬物或抑制劑轉染到NRK-52E細胞中，使其過表達或抑制外泌體miR-21(圖5B)，并通過PCR驗證轉染效果(圖5E)。細胞轉染和TGF-β1處理后，立即在NRK-49F細胞中加入相應的外泌體。如圖5C和5F-I所示，miR-21模擬轉染的NRK-52E細胞的外泌體刺激NRK-49F細胞中Col-I、纖連蛋白和α-SMA的表達及細胞增殖明顯增加。同樣，當miR-21 inhibitor轉染的NRK-52E細胞的外泌體刺激NRK-49F細胞時，Col-I、纖連蛋白和α-SMA的表達以及細胞增殖均明顯下降。

6）PTEN是miR-21的一個潛在靶點

我們進一步研究了腎小管細胞來源的外泌體miR-21介導成纖維細胞激活的可能機制。TargetScan軟件預測PTEN基因的3 '-UTR是miR-21的保守結合位點(圖6A)。為了驗證miR-21與PTEN的關系，我們構建了攜帶PTEN 3’UTR的野生型PTEN (PTEN-WT)熒光素酶報告基因。將帶有PTEN-WT的miR-21模擬物轉染到NRK-49F細胞后，與Ctrl組相比，miR-21模擬物抑制了PTEN-miR-21轉染細胞中的熒光素酶活性(圖6B)。最后，我們通過western blot檢測NRK-49F細胞中PTEN和下游p-Akt的表達水平。當使用miR-21模擬轉染的NRK-52E細胞的外泌體刺激時，PTEN明顯降低，p-Akt升高，但當使用miR-21抑制物轉染的NRK-52E細胞的外泌體刺激時，這些變化被緩解(圖6C-E)。

7）腎小管細胞來源的外泌體miR-21通過PTEN/Akt通路介導體外成纖維細胞激活

為了進一步證實miR-21在PTEN中的作用，NRK-49F細胞在接受NRK-52E遞送的外泌體之前，先用PTEN siRNA處理(圖7A)，與si-NC組相比，PTEN mRNA明顯受到抑制(圖7B)。CCK-8(圖7C)和PTEN的western blot表達(圖7H, K)表明，不經外泌體干預的siPTEN轉染顯著促進了NRK-49F的增殖。在外泌體干預組中，單獨轉染miR-21 inhibitor可抑制NRK-49F增殖，同時轉染siPTEN后明顯逆轉。免疫熒光染色顯示，轉染siPTEN后，NRK-49F細胞中Col-I、纖連蛋白和α-SMA表達明顯增加。在外泌體干預組中，單獨轉染miR-21 inhibitor可抑制上述指標，同時轉染siPTEN后則明顯逆轉。western blot檢測通路相關蛋白PTEN和p-Akt，如圖7H-J所示。未經外泌體干預的siPTEN轉染可顯著抑制PTEN，但加速p-Akt。在外泌體干預組中，單獨轉染miR-21 inhibitor可加速PTEN并抑制p-Akt，但與siPTEN共轉染后這種作用被逆轉。上述結果表明，腎小管細胞來源的外泌體miR-21可以通過PTEN/Akt途徑介導成纖維細胞的激活。

8）腎小管細胞來源的外泌體miR-21通過PTEN/Akt通路促進體內腎纖維化

為驗證外泌體miR-21在體內的作用機制，采用TGFβ1-Exo注射UUO模型進行動物實驗。NRK-52E細胞的TGFβ1-Exos在UUO后7天增加了細胞外基質和成纖維細胞增殖。同時抑制腎小管細胞來源的外泌體中miR-21的表達可抑制成纖維細胞的激活和細胞外基質的產生(圖8A-D, 8E-G)。我們進一步發現腎小管細胞來源的外泌體在UUO后下調PTEN并激活p-Akt。此外，外泌體中抑制miR-21可上調PTEN并抑制p-Akt(圖7F, H-I)。

  結論：我們證明了腎小管細胞來源的外泌體在輸尿管梗阻誘導的腎積水和長期腎纖維化中發揮重要作用。我們發現UUO后含有miR-21的外泌體的產生增加。管狀細胞來源的外泌體miR-21通過靶向PTEN促進成纖維細胞激活，并影響PTEN/Akt通路。這些結果引入了一種新的機制，解釋了UUO模型中細胞-細胞通信是如何由外泌體介導的，并表明外泌體可能是一個新的開發領域，以延緩或減緩腎纖維化的進展。

參考文獻：Zhao S, Li W, Yu W, Rao T, Li H, Ruan Y, Yuan R, Li C, Ning J, Li S, Chen W, Cheng F, Zhou X. Exosomal miR-21 from tubular cells contributes to renal fibrosis by activating fibroblasts via targeting PTEN in obstructed kidneys. Theranostics. 2021 Aug 2;11(18):8660-8673. doi: 10.7150/thno.62820.