環(huán)狀RNA (Circular RNAs, CircRNAs)因參與多種生物的生物進(jìn)程、涉及多種疾病近年來(lái)被廣泛關(guān)注，雖然阿爾茨海默病(AD)中CircRNA的差異表達(dá)譜已經(jīng)建立，但在基因表達(dá)和疾病相關(guān)認(rèn)知中，與AD直接相關(guān)的關(guān)鍵CircRNA的特征和功能尚不清楚。本文中，作者篩選并鑒定出AD相關(guān)的新CircRNA，CircCwc27，并探索其分子機(jī)制。本文于2021年9月發(fā)表在《FEBS Journal》上，IF=10.7。

CircCwc27在阿爾茲海默癥（AD）患者中上調(diào)表達(dá)

異常的CircRNA可能直接導(dǎo)致疾病的發(fā)生，篩選AD早期相關(guān)的CircRNA， 作者對(duì)6個(gè)月的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和WT對(duì)照小鼠的海馬進(jìn)行了深度CircRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)131個(gè)表達(dá)異常的CircRNA ，其中上調(diào)，下調(diào)最顯著的15個(gè)CircRNA在熱圖中顯示（Figs. 1A），與野生型小鼠相比，其中有4個(gè)顯著上調(diào)和4個(gè)顯著下調(diào)的CircRNA在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬體中表達(dá)（Figs. 1B）。接下來(lái)對(duì)這8種CircRNA在AD患者的血漿和顳葉皮層中的水平進(jìn)行檢測(cè)，并比較了其在海馬體中的相對(duì)豐度。結(jié)果顯示，在AD患者的顳葉皮層和血漿中可以檢測(cè)到CircCwc27表達(dá)量較高，與在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到的一致（Figs. 1C），而且CircCwc27在海馬體區(qū)表達(dá)上升最顯著（Figs. 1D）。但線性Cwc27在皮層和海馬體中的表達(dá)均未發(fā)生變化。因此，將CircCwc27在AD中的功能特性作為研究的重點(diǎn)。

CircCwc27是一種豐富、穩(wěn)定的環(huán)狀RNA，主要分布于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中

為了進(jìn)一步了解CircCwc27的作用，我們使用原位雜交和qRT-PCR方法來(lái)評(píng)估CircCwc27在大腦中的表達(dá)。結(jié)果顯示，CircCwc27在AD患者比較脆弱的大腦皮質(zhì)和海馬體中高表達(dá)（Figs. 1E）。此外，在兩組小鼠中，CircCwc27主要在神經(jīng)元細(xì)胞而非膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)（Fig 1F,G）。還檢測(cè)到，在每個(gè)海馬體神經(jīng)元中，平均有98個(gè)CircCwc27拷貝，在每個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，平均有78個(gè)CircCwc27的拷貝（Fig 1H）。原位雜交與免疫染色進(jìn)一步證實(shí)APP/PS1小鼠神經(jīng)元中CircCwc27表達(dá)量較高。

Figure 1 CircCwc27是一個(gè)高度豐富和穩(wěn)定的circRNA，在AD中上調(diào)

在APP/PS1小鼠中，CircCwc27基因的敲除可改善認(rèn)知衰退

為了確定CircCwc27的表達(dá)是否影響AD的行為缺陷和病理特征，作者在9個(gè)月大的小鼠中通過(guò)慢病毒注射進(jìn)行了CircCwc27干擾處理(LV-sh-CircCwc27)，同時(shí)設(shè)置了對(duì)照(LV-shCircCon)（Figs.2A），并在2個(gè)月后分析它們的記憶和空間學(xué)習(xí)能力。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)在整個(gè)皮質(zhì)和海馬區(qū)廣泛分布，并與神經(jīng)元共定位（Figs.2B,C）。慢病毒轉(zhuǎn)染后，CircCwc27表達(dá)顯著降低，但Cwc27水平保持不變（Figs.2D）。Y迷宮自發(fā)交替行為測(cè)試顯示注射LV-sh-CircCon的APP/PS1小鼠表現(xiàn)出明顯的交替性下降，而進(jìn)行CircCwc27干擾卻明顯阻止了交替性下降（Figs.2E），4組描述運(yùn)動(dòng)功能均未出現(xiàn)缺陷（Figs.2F）。該研究中還進(jìn)行了Morris水迷宮任務(wù)來(lái)評(píng)估小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶。在訓(xùn)練階段, 注射LV-sh-CircCon的APP/PS1小鼠表現(xiàn)找到隱藏的平臺(tái)的速度明顯緩慢,而注射LV-sh-CircCwc27能改善小鼠學(xué)習(xí)能力（Figs. 2G,H）。在調(diào)查試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)下調(diào)CircCwc27的表達(dá)可以改善APP/PS1小鼠的空間記憶(Figs. 2I, K)。在實(shí)驗(yàn)中，兩組小鼠的游泳速度沒(méi)明顯（Figs.2J）。總之，這些數(shù)據(jù)都表明了CircCwc27基因的抑制在很大程度上改善了AD的認(rèn)知能力下降。

Figure 2敲掉circCwc27可以提高APP/PS1小鼠模型的空間學(xué)習(xí)記憶能力

CircCwc27下調(diào)可預(yù)防APP/PS1小鼠Aβ沉積及相關(guān)的神經(jīng)退行性影響

行為測(cè)試后，進(jìn)一步探索CircCwc27對(duì)AD病理的影響。研究中用抗Aβ抗體對(duì)APP/PS1小鼠的腦切片進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，注射LV-shCircCwc27的小鼠斑塊負(fù)荷明顯減輕（Figs.3A），還發(fā)現(xiàn)注射LV-shCircCwc27后，皮質(zhì)和海馬的可溶性和不可溶性aβ40和aβ42也持續(xù)減少（Figs.3B-E）。此外，APP/PS1小鼠中，CircCwc27的表達(dá)與Aβ40和a β42的水平呈正向關(guān)（Figs.3F,G）。鑒于LV-sh-CircCwc27注射液對(duì)斑塊沉積的保護(hù)作用，我們通過(guò)LAMP1抗體免疫染色檢測(cè)了CircCwc27敲低是否影響軸突萎縮，因?yàn)樵贏D小鼠模型中，LAMP1陽(yáng)性營(yíng)養(yǎng)不良神經(jīng)突與Aβ斑塊密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)注射LV-sh-CircCwc27的小鼠海馬中Aβ與營(yíng)養(yǎng)不良神經(jīng)突共定位的面積顯著減少(Figs. 3H)。此外，還確定了CircCwc27對(duì)突觸完整性的，LV-sh-CircCwc27注射并不影響突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，而在APP/PS1小鼠中則顯著防止突觸相關(guān)蛋白降低(Figs. 3I)。小鼠腦切片免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。神經(jīng)炎癥是AD的另一個(gè)重要病理標(biāo)志。研究中注射LV-sh-CircCwc27顯著降低了APP/PS1小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性(Figs. 3J)。以上結(jié)果表明，敲除CircCwc27在AD的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性影響中具有保護(hù)作用。

Figure3.抑制circCwc27可改善APP/PS1小鼠的AD情況

CircCwc27能直接與Pur-α蛋白結(jié)合，并影響Pur-α蛋白分布

為進(jìn)一步探索CircCwc27引起AD的分子機(jī)制，作者假設(shè)CircCwc27具有翻譯功能，但通過(guò)RegrRNA2.0分析，并未發(fā)現(xiàn)CircCwc27序列中包含開(kāi)放的閱讀框架(ORF)，表明CircCwc27不能編碼短肽。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，在細(xì)胞質(zhì)中，大腦中的CircRNA能夠作為miRNA海綿,于是作者檢測(cè)了細(xì)胞質(zhì)CircCwc27是否能與神經(jīng)元中的miRNA結(jié)合。AGO2是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的核心成分，也是CircRNA吸附miRNAs的必要條件。作者通過(guò)RNA免疫沉淀(RIP)，觀察到內(nèi)源性CircCwc27并未在AGO2上富集（Figs.4A），說(shuō)明CircCwc27并不作為miRNA的海綿發(fā)揮功能。于是，在APP/PS1小鼠中先通過(guò)RNA pull-down，再用質(zhì)譜(MS)分析來(lái)尋找潛在的與CircCwc27相互作用的蛋白（Figs.4B），CircCwc27連接探針共拉下154個(gè)蛋白。GO富集分析表明，這些蛋白大部分與RNA結(jié)合相關(guān)（Figs.4C）。根據(jù) RBPDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這154個(gè)蛋白中有85個(gè)是RNA結(jié)合蛋白（RBP）(Figs. 4B)，篩選5個(gè)肽數(shù)最大的RBP進(jìn)行進(jìn)一步研究。RIP實(shí)驗(yàn)表明，CircCwc27能被Pur-α和HNRNPK抗體拉下（Figs.4D）。此外，與轉(zhuǎn)染CircMock的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染CircCwc27的細(xì)胞中，Pur-α和HNRNPK能夠顯著拉下更高水平CircCwc27（Figs.4D）。RIP實(shí)驗(yàn)表明Pur-α對(duì)CircCwc27具有最大的結(jié)合能力，這與質(zhì)譜結(jié)果一致(Pur-α在所有被CircCwc27拉下的蛋白中顯示出最多的肽數(shù))，表明Pur-α介導(dǎo)CircCwc27功能，對(duì)CircCwc27具有重要的作用 (Figs.4D)。RNA下拉結(jié)果也驗(yàn)證了CircCwc27與Pur-α的直接相互作用(Figs.4E)。于是，進(jìn)一步進(jìn)行CircCwc27和Pur-α之間的內(nèi)源性共定位(Figs.4F)。

已有研究表明，甘氨酸結(jié)構(gòu)域和Pur-α中的PUR重復(fù)結(jié)構(gòu)域可能負(fù)責(zé)招募RNA分子，因此作者構(gòu)建了Pur-α全長(zhǎng)和截?cái)噘|(zhì)粒。RIP檢測(cè)結(jié)果表明PUR重復(fù)域(66-246aa)與CircCwc27直接結(jié)合(Figs.4G)。作者進(jìn)一步研究了CircCwc27對(duì)Pur-α的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CircCwc27的下調(diào)并不影響總Pur-α mRNA和蛋白水平，但CircCwc27引起的Pur-α沉淀的水平顯著上調(diào)。與野生型小鼠相比，APP/PS1和APP/PS1- lv -sh- Circon小鼠中CircCwc27沉淀的Pur-α顯著上調(diào)(Figs.4H)。

在APP/PS1小鼠中敲低CircCwc27，CircCwc27和Pur-α的結(jié)合顯著降低(Figs.4H)。RIP測(cè)定也得到了類(lèi)似的結(jié)果(Figs.4I)。由于CircCwc27主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，并且在AD中上調(diào)，我們探討了增強(qiáng)CircCwc27和Pur-α之間的結(jié)合是否影響了Pur-α的分布。免疫印跡結(jié)果顯示，APP/PS1小鼠中Pur-α在細(xì)胞核中的表達(dá)明顯減少，而在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯增加(Figs.4J, K)。注射LV-shCircCwc27可顯著促進(jìn)Pur-α的分布(Figs.4J, K)。

Figs.4 CircCwc27與Pur-α蛋白相互作用，并影響Pur-α分布

Pur-α降低AD患者Aβ負(fù)荷，防止認(rèn)知功能下降 

最近研究表明，Pur-α在硬化癥和額顳葉癡呆中起重要作用。但對(duì)Pur-α在AD中的作用知之甚少。由于Pur-α是CircCwc27的直接靶點(diǎn)，研究中通過(guò)注射與腺癌病毒相關(guān)的、攜帶flag標(biāo)記物的Flag-AAV9-Control和Flag-AAV9-Pur-α到APP/PS1小鼠海馬體中，觀察Pur-α對(duì)AD病理的影響。注射兩個(gè)月后，在小鼠海馬體中出現(xiàn)明顯的綠色熒光，說(shuō)明存在有效轉(zhuǎn)導(dǎo)(Figs.5A-C)。然而，CircCwc27在Pur-α過(guò)表達(dá)的大腦中表達(dá)沒(méi)有變化(Figs.5D)。與對(duì)照組相比，Pur-α過(guò)表達(dá)顯著減少APP/PS1小鼠海馬區(qū)Aβ沉積和促炎因子(Figs 5E, F)。注射Flag-AAV9-Pur-α在很大程度上保護(hù)APP/PS1小鼠免于嚴(yán)重的記憶缺陷(圖5G-I)。綜上所述，Pur-α可減少Aβ沉積，挽救空間記憶損傷。

Figs.5 Pur-α可減少Aβ沉積，并預(yù)防AD認(rèn)知功能下降

CircCwc27通過(guò)與Pur -α結(jié)合來(lái)調(diào)控AD基因的轉(zhuǎn)錄

以往研究發(fā)現(xiàn)，Pur-α有助于記憶保持和加強(qiáng)學(xué)習(xí)能力，并抑制APP的表達(dá)。結(jié)合組著的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CircCwc27可以與Pur-α結(jié)合，過(guò)表達(dá)Pur-α在很大程度上抑制了CircCwc27基因的表達(dá)，改善了Aβ負(fù)荷和認(rèn)知功能下降的情況。作者推測(cè)，在AD患者中，Pur-α是CircCwc27下游的調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控a β和記憶相關(guān)基因。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者對(duì)APP/PS1小鼠的海馬體進(jìn)行了lv-sh-Circcon-和LV-shCircCwc27-注射，并進(jìn)行RNA-seq，篩選出鑒定了339個(gè)差異表達(dá)基因(Figs. 6A)。有意思的是，CircCwc27敲低后，APP和膜金屬內(nèi)肽酶（Mme）這兩個(gè)負(fù)責(zé)Aβ代謝的基因也受到調(diào)節(jié)。不僅如此，學(xué)習(xí)和記憶方面的基因表達(dá)量顯著上調(diào)(Figs. 6B–D)。而結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在APP/PS1小鼠和AD患者中，大部分CircCwc27調(diào)控基因的表達(dá)都發(fā)生了改變(Figs. 6E, F)。除了APP和Mme，多巴胺受體D1 (Drd1)、蛋白磷酸酶1、調(diào)節(jié)抑制劑亞單位1b (Ppp1r1b)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)酪氨酸激酶受體1型(Ntrk1)和Lhx8這些已報(bào)道的參與了AD的病理過(guò)程的基因表達(dá)都發(fā)生改變。除了與RNA分子相互作用外，Pur-α還可以與RNA分子結(jié)合并參與許多細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄控制，為了檢驗(yàn)CircCwc27是否通過(guò)介導(dǎo)Pur-α與其啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，作者進(jìn)行了ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了Pur-α直接結(jié)合到由CircCwc27控制的AD患者中異常基因的啟動(dòng)子上(Figs. 6G)。接下來(lái)，對(duì)CircCwc27進(jìn)行敲低處理發(fā)現(xiàn)對(duì)Pur-α在其靶點(diǎn)啟動(dòng)子上富集確實(shí)受到影響。ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)表明，CircCwc27敲低可逆轉(zhuǎn)Pur-α與這些基因啟動(dòng)子結(jié)合減少的現(xiàn)象(Fig. 6H)。因此，該研究表明，CircCwc27通過(guò)與Pur-α結(jié)合，減少了Pur-α對(duì)AD相關(guān)基因啟動(dòng)子的招募。

Figs.6 CircCwc27通過(guò)與Pur-α結(jié)合調(diào)控AD基因的轉(zhuǎn)錄

本文發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與阿爾茲海默癥直接相關(guān)的CircRNA- CircCwc27，并闡明了CircCwc27通過(guò)與Pur-α結(jié)合，使Pur-α減少了對(duì)AD相關(guān)基因啟動(dòng)子的招募，進(jìn)而影響阿爾茲海默癥進(jìn)程的機(jī)制。

1.  Song, C., et al., Circular RNA Cwc27 contributes to Alzheimer's disease pathogenesis by repressing Pur-alpha activity. Cell Death Differ, 2021.