M2極化是抗腫瘤巨噬細胞，即與M1極化相比，促腫瘤的腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）高表達白細胞介素-4受體（IL4R）。本研究中，作者利用M1巨噬細胞來源的外泌體，通過重編程TAMs為M1型巨噬細胞，從而促進M1極化和靶向IL4R，最終抑制腫瘤生長。本文于2021年9月發表在《Biomaterials》IF：12.479期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、M1外泌體的特性以促進M1極化和靶向IL4R

如圖1A所示，超離心法從M1巨噬細胞培養基分離出每只小鼠20 ~ 30 μg的外泌體。然后為了通過IL4R靶向M2巨噬細胞，使用DOPE-PEG-NHS膜磷脂為基礎的錨定物（IL4Rp-1-Exo(si/mi)），用IL4Rp-1對Exo(si/mi)進行表面修飾。NTA分析顯示M1外泌體、Exo(si/mi)、IL4R-Exo(si/mi)和IL4Rpep -1標記的M1外泌體(IL4R-Exo)相似（圖1B-1E）。此外，M1和M2巨噬細胞外泌體都有相似水平的Alix和CD63表達，但是M1有更高的iNOS表達和更富豐的促炎性因子（IL-6，IL-12，IFN-γ）；并且細胞裂解液中含有細胞標記物，如鈣聯蛋白和組蛋白，但外泌體中不含，這表明外泌體中不含死細胞的細胞碎片（圖1F-1G）。

圖1 IL4R靶向M1外泌體的制備與表征

隨后，為了檢測血漿中IL4RPep-1在外泌體膜的保留時間，作者使用CD63抗體捕獲外泌體，用流式檢測其表達，結果如圖2B-2D所示，直至孵育后24小時內外泌體表達都沒有顯著改變，IL4RPep-1的血漿穩定性也在24小時內穩定不變。表明用DOPE-PEG-NHS錨定的IL4RPep-1外泌體至少可以在血漿中穩定存在24小時。

圖2 IL4RPep-1的保留和血清穩定性，NF-κB p50 siRNA和miR-511-3p的包封入M1外泌體

2、IL4R-靶向的M1外泌體可有效被內化和傳輸至M2巨噬細胞并激活M1極化

如圖3A和圖3C所示，相比于未標記的外泌體，IL4R-Exo和多肽標記的外泌體（Ctrl-Exo）都可以被M1巨噬細胞有效內化，但是，相反的是，與Ctrl-Exo相比，IL4R-Exo可以更為有效的被M2巨噬細胞內化（圖3B和圖3C）。IL4R-Exo(si)負載紅色熒光標記的對照siRNA可以更有效的將siRNA傳遞入M2巨噬細胞，與untargeted Exo(si)相比，但該過程可以被IL4R阻斷性抗體抑制（圖3D）。此外，IL4R-Exo(si)裝載miR-511–3p運輸至M2巨噬細胞的效率也更高，如圖3E。

圖3通過IL4R靶向的M1-Exo將siRNA和miRNA內化并傳遞到M2巨噬細胞

隨后，檢測IL4R-Exo(si/mi)能否有效的下調M2巨噬細胞中靶基因的表達。結果如圖4所示，IL4R-Exo(si/mi)降低了NF-κB p50和ROCK2的表達，以及M2標志物Arg1和IL-10表達，同時增加了M1標志物IL12p40和iNOS的表達。這表明靶向M2巨噬細胞的IL4R可以使M1來源外泌體有效的傳遞siRNA和miRNA進入M2巨噬細胞，隨即下調靶基因的表達促進巨噬細胞重編程轉變為M1表型。

為了驗證M1來源外泌體對于促進M2重編程的效果，作者加入了非免疫性的正常細胞HEK 293來源的外泌體（(HEK-Exo），結果顯示它不能影響NF-κB p50和ROCK2的表達，以及M1和M2標志物的表達（圖4）。再次證實了IL4R-Exo(si/mi)能有效調控M2巨噬細胞重編程。

圖4 IL4R靶向的M1外泌體對靶基因和巨噬細胞極化標記物的調控

3、IL4R靶向的M1外泌體在小鼠中聚集于腫瘤但很少在肝臟分布

研究表明大量系統管理的外泌體在體內網狀內皮系統中積累，特別是在肝臟中。于是，作者檢測了是否IL4R靶向的M1外泌體表面修飾可以減少肝臟的系統性外泌體攝取而增強其腫瘤集聚的活性。對于體內追蹤，這里使用的是DiD熒光標記外泌體和4T1負荷乳腺癌腫瘤。將表達熒光素酶的4T1-luc腫瘤細胞接種到乳腺脂肪墊中，通過全身生物發光成像監測腫瘤生長（圖5A）。外泌體注射2小時后拍攝的全身熒光成像顯示，IL4R-Exo(si/mi)歸屬于腫瘤區域，而M1外泌體和對照肽標記的Ctrl-Exo(si/mi)分布于全身，腫瘤歸屬較少（圖5B）。體外組織成像和定量顯示，從IL4R-Exo(si/mi)組分離出的腫瘤具有更高水平熒光信號，而M1外泌體對照組則是在肝，肺，脾中顯著聚集，Ctrl-Exo(si/mi)組則分布全身少量聚集于腫瘤（圖5C-5D）。此外，與Ctrl-Exo(si/mi)相比，IL4R靶向外泌體顯著富集于腫瘤，并且和IL4R和CD206在腫瘤里有明顯共定位表達（圖5E-5F）。

圖5IL4R靶向的M1外泌體在小鼠中的腫瘤歸屬和生物分布

4、IL4R靶向的M1外泌體抑制腫瘤生長，重編程M2型TAM向M1型轉變，并增強抗腫瘤免疫

為了檢測IL4R-Exo(si/mi)的抗腫瘤生長活性，作者通過尾靜脈注射外泌體至4T1負載小鼠中（圖6A）。結果顯示IL4R-Exo(si/mi)可以顯著降低小鼠腫瘤的體積和腫瘤以及小鼠體重，同時下調腫瘤和淋巴結中NF-κB p50和ROCK2的表達。提示， IL4R-Exo(si/mi)具有抗腫瘤活性。

圖6 IL4R靶向的M1外泌體對4T1乳腺腫瘤小鼠的抗腫瘤生長活性及靶基因的下調

為了檢測IL4R-Exo(si/mi)重編程M2型TAM的能力，作者檢測了4T1腫瘤微環境中M2和M1標志物的表達情況，結果如圖7A-F所示，IL4R-Exo(si/mi)顯著下調了M2型標志物的表達，如Arg1，TFG-β，IL-10和IL-4，顯著增高了M1型標志物的表達，如IL-12p40和IFN-γ。

之后，分析了治療后腫瘤組織中的免疫細胞群，結果發現IL4R-Exo(si/mi)顯著減少了免疫抑制的M2巨噬細胞，即含有細胞內IL-10、MDSCs和Tregs的IL-10+巨噬細胞的數量，同時顯著增加了M1細胞群和CD8+ T細胞（圖7G-7M），但CD4+ T細胞的數量不受影響。

以上表明IL4R靶向的M1外泌體具有對4T1乳腺腫瘤小鼠的抗腫瘤生長活性及將M2巨噬細胞重編程為M1樣巨噬細胞并增加抗腫瘤免疫的能力。

圖7在4T1腫瘤微環境中，通過IL4R靶向M1外泌體將M2巨噬細胞重編程為M1樣巨噬細胞并增加抗腫瘤免疫

參考文獻：

Gunassekaran Gowri Rangaswamy., Poongkavithai Vadevoo Sri Murugan., Baek Moon-Chang., Lee Byungheon.(2021). M1 macrophage exosomes engineered to foster M1 polarization and target the IL-4 receptor inhibit tumor growth by reprogramming tumor-associated macrophages into M1-like macrophages. Biomaterials, 278(undefined), 121137. doi:10.1016/j.biomaterials.2021.121137