鐵死亡是一種新定義的受調節細胞死亡形式。靶向鐵死亡被認為是一種新的抗癌策略。盡管越來越多的證據表明抗糖尿病二甲雙胍作為抗癌劑的潛在功效，但尚未完全闡明這種功效背后的確切機制。我們研究發現二甲雙胍以不依賴 AMPK 的方式誘導鐵死亡以抑制腫瘤生長。從機制上講，我們證明二甲雙胍增加細胞內 Fe2+ 和脂質 ROS 水平。具體而言，二甲雙胍通過抑制其 UFMylation過程來降低 SLC7A11 的蛋白質穩定性。此外，二甲雙胍與柳氮磺吡啶系統xc-抑制劑聯合使用可以協同作用誘導鐵死亡并抑制乳腺癌細胞的增殖。該研究首次證明二甲雙胍誘導鐵死亡的能力可能是其抗癌作用的一種新機制。此外，我們發現SLC7A11是一種新的UFMylation底物，并發現針對UFM1/SLC7A11通路可能是一種有前景的癌癥治療策略。本文于2021年6月發表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.161）期刊上。

技術路線

結果：

1）二甲雙胍觸發鐵依賴性細胞死亡

越來越多的證據表明二甲雙胍在臨床預防和治療乳腺癌方面具有巨大的潛力。我們的研究表明二甲雙胍能有效地抑制乳腺癌細胞的增殖，且呈劑量和時間依賴性(圖1A)。接下來，我們探討哪些細胞死亡形式參與二甲雙胍在乳腺癌細胞的抗癌活性。我們使用了多種細胞死亡抑制劑，包括Z-VAD-FMK(一種凋亡抑制劑)、necrosulfonamide (一種壞死抑制劑)和3-Methyladenine (3-MA，一種自噬抑制劑)。由于二甲雙胍已被證明可以調節細胞中的鐵穩態，我們還引入了一種鐵清道夫，脫鐵胺(DFO)。結果顯示DFO恢復了二甲雙胍培養的T47D和MCF7細胞的活力(圖1B)。Z-VAD-FMK、necrosulfonamide和3-MA也較DMSO組略微提高了細胞存活率(圖1 B)。雖然二甲雙胍可以誘導細胞凋亡并抑制自噬，但DFO的作用遠比凋亡和自噬抑制劑顯著(圖1B)。此外，二甲雙胍促進了鐵離子的積累，而DFO抑制了鐵離子水平的升高(圖1C和D)。碘化丙啶染色證實，DFO抑制了二甲雙胍誘導的T47D細胞死亡(圖1E)。綜上所述，二甲雙胍的抗癌作用需要鐵離子，而二甲雙胍誘導的鐵離子增加可能是二甲雙胍發揮抗癌作用的機制之一。

2）二甲雙胍可引起鐵死亡

為了闡明二甲雙胍和鐵死亡之間的關系，我們首先研究了二甲雙胍對鐵死亡形態學特征的影響。鐵透射電鏡顯示，二甲雙胍誘導MCF7和T47D細胞線粒體體積減小，膜密度增加(圖2A)。接下來，我們重點研究了二甲雙胍對鐵死亡生化過程的影響。我們用不同濃度的二甲雙胍處理乳腺癌細胞。研究結果顯示，二甲雙胍提高了細胞內總ROS和脂質ROS的水平，脂質ROS的增加被ferroptosis抑制劑(DFO, Fer-1)抑制，而DFO和Fer-1本身對其影響不大(圖2B和C)。此外，二甲雙胍還能降低細胞內谷胱甘肽水平(圖2D)。我們還檢測了鐵死亡抑制劑(DFO, Fer-1)是否可以逆轉二甲雙胍的抗癌作用。我們的結果表明，二甲雙胍處理T47D細胞時，DFO和Fer-1都能顯著挽救細胞活力(圖2E)。此外，碘化丙啶染色證實，fer1可抑制二甲雙胍誘導的T47D細胞死亡(圖2f)。綜上所述，二甲雙胍可引起鐵死亡。

3）二甲雙胍抑制SLC7A11的表達

為了明確二甲雙胍調控鐵死亡的具體分子機制，我們檢測了不同二甲雙胍濃度和處理時間對SLC7A11和GPX4表達的影響。結果顯示，二甲雙胍能有效抑制T47D和MCF7細胞中SLC7A11的表達，且呈劑量和時間依賴性，而轉錄水平顯著升高(圖3A和B)。但二甲雙胍對GPX4的表達無顯著影響(圖3A)。為了進一步闡明SLC7A11在二甲雙胍抗癌作用中的作用，我們在T47D細胞中敲除或過表達SLC7A11。結果表明，SLC7A11過表達顯著逆轉二甲雙胍的抗癌作用和GSH的上調(圖3C和D)。這些結果提示二甲雙胍可以通過下調SLC7A11蛋白水平而誘導鐵死亡抑制癌癥。

4）二甲雙胍可調節UFM1的表達

UFMylation是一種泛素樣修飾，在乳腺癌的發生和發展中起重要作用。通過對DRUGSURV數據庫的分析，我們發現二甲雙胍可以間接靶向UFM1(圖4A)。我們推測UFM1可能在二甲雙胍的抗癌作用中發揮一定的作用。結果顯示，二甲雙胍在一定程度上抑制了UFM1蛋白水平和UFMylation修飾水平(圖4B)，但不影響UFM1轉錄水平(圖4C)。為進一步闡明UFM1對二甲雙胍抑瘤活性的影響，在T47D細胞中過表達UFM1。結果表明，過表達UFM1可有效阻斷二甲雙胍的抗癌作用，恢復二甲雙胍介導的GSH抑制水平(圖4 D和E)。綜上所述，二甲雙胍可能通過UFM1發揮抗癌作用。

5）二甲雙胍通過抑制SLC7A11的UFMylation而下調SLC7A11的表達

鐵死亡受到SLC7A11的密切調控，因此，探索其調控機制有助于進一步找到誘導鐵死亡在癌癥治療中的新的治療靶點。我們首先檢測了SLC7A11和UFM1在不同乳腺癌細胞株中的表達。結果顯示，SLC7A11與UFM1蛋白水平之間存在明顯的正相關(圖5A)。其次，生物信息學分析表明SLC7A11的表達與乳腺癌患者的預后存在顯著的負相關，而UFM1的表達與乳腺癌患者的預后沒有顯著的負相關(圖5 B)。為了確定SLC7A11和UFM1是否具有調控作用，我們在敲低UFM1后檢測SLC7A11表達的影響。結果表明，抑制UFM1可下調SLC7A11的表達，但不影響其轉錄水平(圖5C)。此外，抑制UFM1抑制了SLC7A11的蛋白穩定性(圖5D)。為了確定SLC7A11是否可以被UFM1修飾，我們檢測了在UFM1敲低或不敲低情況下SLC7A11的UFMylation。我們發現SLC7A11是UFMylation的底物，其修飾的特異性通過敲除UFM1來確定(圖5E)。進一步的UFMylation修飾試驗表明，SLC7A11 UFMylation可以被UfSP2抑制(圖5F)。這些發現將SLC7A11定義為UFM1的一種新的修飾底物。此外，二甲雙胍能有效抑制SLC7A11 UFMylation水平(圖5G)。綜上所述，二甲雙胍通過抑制SLC7A11的UFMylation來下調SLC7A11的蛋白穩定性，從而誘導鐵死亡。

6）二甲雙胍可誘導不依賴于AMPK途徑的鐵死亡

目前，許多研究表明二甲雙胍可以直接作用于腫瘤細胞，通過AMPK依賴或AMPK不依賴的信號通路發揮其抗腫瘤生物學作用。我們的結果也表明二甲雙胍可以激活AMPK磷酸化(圖6A)。因此，為了確定AMPK通路是否參與二甲雙胍對鐵死亡的調控，我們首先明確AMPK的激活是否能誘導鐵死亡。結果顯示，AICAR，一種AMPK活化劑，增加脂質ROS生產和抑制SLC7A11表達，表明AMPK活化可以誘導鐵死亡(圖6 E和F)。此外，二甲雙胍與化合物C聯合作用可協同提高脂質ROS水平，抑制GSH水平和SLC7A11的表達(圖6 A, B, C)。化合物C本身可以增加脂質ROS和Fe2+的產生(圖6 C和D)?？傊@些發現表明二甲雙胍或AMPK失衡均可誘導鐵死亡，而二甲雙胍可誘導鐵死亡而不涉及AMPK。

7）SAS與二甲雙胍的協同作用能有效抑制乳腺癌細胞

我們用二甲雙胍聯合SLC7A11抑制劑磺胺吡啶處理細胞。隨后，我們采用CCK8法檢測細胞活力，以確定二甲雙胍與磺胺吡啶聯合使用的協同效應。結果表明，磺胺吡啶和二甲雙胍聯合作用可以協同抑制乳腺癌的增殖，特別是MDAMB231細胞(圖7A)。此外，磺胺吡啶與二甲雙胍聯合使用誘導線粒體體積減小，膜密度增加(圖7B)。脂質過氧化檢測和谷胱甘肽檢測顯示，二甲雙胍和磺胺吡啶聯合使用顯著提高脂質ROS水平，抑制谷胱甘肽的生成(圖7C, D)。DFO和Fer-1有效地減弱了二甲雙胍和磺胺吡啶聯合用藥的殺傷效果(圖7E)。我們的數據表明，磺胺吡啶和二甲雙胍聯合使用可協同誘導脂質過氧化和鐵死亡，從而抑制乳腺癌的增殖。

8）磺胺吡啶可協同增強二甲雙胍的體內抗癌活性

我們研究了磺胺吡啶是否能增強二甲雙胍的體內抗癌活性。與DMSO組相比，二甲雙胍和磺胺吡啶明顯抑制腫瘤生長(圖8A和B)。在四組中，二甲雙胍和磺胺吡啶聯合抑制腫瘤生長的效果最高。此外，二甲雙胍和磺胺吡啶處理的小鼠表現出較低的UFM1和SLC7A11表達和較高的4-HNE表達(圖8C)。這些數據表明，磺胺吡啶可使癌細胞對二甲雙胍誘導的脂質過氧化和鐵死亡敏感，從而在體內抑制腫瘤。

結論：這項研究是第一次建立二甲雙胍和鐵死亡之間的聯系。我們的數據提示了二甲雙胍的一種新的抗癌機制，即二甲雙胍通過抑制SLC7A11的UFMylation而誘導鐵死亡。