miR-101-3p可用于治療多種腫瘤的治療，但是它的抗腫瘤機(jī)制仍然未知，并且其用于體內(nèi)腫瘤治療的確切策略也尚不可知。本研究探究了miR-101-3p對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制機(jī)制，并開發(fā)了相應(yīng)的體內(nèi)治療納米藥物。本文于2021年6月發(fā)表在《Redox Biology》IF：11.799期刊上。

技術(shù)路線：

主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、miR-101-3p的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中下降

作者檢測(cè)了6株肺癌細(xì)胞系A549，L78，NCI–H460，GLC-82，SPC-A1，PC9和一株人上皮細(xì)胞系BEAS-2B中miR-101-3p的表達(dá)，結(jié)果顯示與BEAS-2B相比，miR-101-3p的表達(dá)在肺癌細(xì)胞系中顯著低表達(dá)。隨后檢測(cè)了32個(gè)肺癌組織（LC）樣本和同源相鄰正常組織（ANT）樣本中的表達(dá)，結(jié)果顯示與ANT相比，在LC中顯著低表達(dá)。隨后將32例LC樣本根據(jù)腫瘤大小分為兩組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-101-3p在腫瘤體積大的樣本中的表達(dá)要顯著低于腫瘤體積小的。這些結(jié)果表明miR-101-3p的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中下調(diào)。

圖1 miR-101-3p的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中降低

2、促進(jìn)miR-101-3p的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并增強(qiáng)凋亡

為了進(jìn)一步探頭miR-101-3p對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，構(gòu)建了miR-101-3p過表達(dá)和miR-101-3p表達(dá)抑制的細(xì)胞系，如圖2A所示。隨后，CCK8，流式和WB等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)miR-101-3p會(huì)抑制細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，并抑制Ki67和PCNA的表達(dá)，但會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡比例，以及增加cleaved-Caspase3的表達(dá)減少Bcl-2的表達(dá)。相反地，抑制miR-101-3p的表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并減少細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明miR-101-3p在腫瘤增殖和凋亡中發(fā)揮了重要作用。

圖2初步探討miR-101-3p對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的抑制作用

3、miR-101-3p抑制腫瘤細(xì)胞通過靶向TBLR1

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析顯示miR-101-3p在TBLR1的3’UTR區(qū)域存在3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。作者此前的研究結(jié)果表明TBLR1是一個(gè)肝癌和宮頸癌的原癌基因，也有證據(jù)顯示其也是肺癌中的原癌基因。因此，探討了miR-101-3p和TBLR1的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示在32例LC樣本中它們的表達(dá)負(fù)相關(guān)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-101-3p mimics和TBLR1野生型共轉(zhuǎn)染時(shí)熒光素酶活性顯著下降，而和TBLR1突變型共轉(zhuǎn)染時(shí)沒有顯著改變，表明miR-101-3p和TBLR1之間存在結(jié)合關(guān)系。進(jìn)一步地，WB結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-101-3p后TBLR1的表達(dá)顯著下降，抑制miR-101-3p的表達(dá)則促進(jìn)TBLR1的表達(dá)。這些結(jié)果表明，miR-101-3p可能通過結(jié)合TBLR1的3'UTR區(qū)域直接控制TBLR1的表達(dá)水平。

圖3 初步探索miR-101-3p產(chǎn)生治療作用的靶點(diǎn)

為了進(jìn)一步探究miR-101-3p作用于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的作用是否是通過調(diào)節(jié)TBLR1的表達(dá)，作者進(jìn)行了回復(fù)實(shí)驗(yàn)。如圖4所示，單獨(dú)轉(zhuǎn)染TBRL1過表達(dá)載體，會(huì)顯著上調(diào)TBLR1的蛋白表達(dá)，減少腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和Bcl-2的表達(dá)，而同時(shí)供轉(zhuǎn)染TBRL1過表達(dá)載體和miR-101-3p mimics則會(huì)顯著抵消上述作用。表明miR-101-3p作用于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的作用是通過調(diào)節(jié)TBLR1的表達(dá)。

圖4 miR-101-3p靶點(diǎn)產(chǎn)生治療作用的體外功能驗(yàn)證

4、miR-101-3p/TBLR1軸調(diào)節(jié)鐵死亡并可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)

通常，癌細(xì)胞的突變會(huì)顯著阻礙細(xì)胞凋亡的激活。因此，探索了miR-101-3p /TBLR1軸激活凋亡進(jìn)而抑制增殖的分子機(jī)制。作者此前的研究表明TBLR1會(huì)顯著抑制NF-kB通路的活性。據(jù)報(bào)道，NF-kB通路可以通過GPX4或PTGS2調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的鐵死亡。因此，作者探究了miR-101-3p/TBLR1軸對(duì)鐵死亡的影響。共聚焦顯微鏡顯示miR-101-3p過表達(dá)后細(xì)胞中總體ROS水平顯著增加，GPX4的表達(dá)顯著下降，PTGS2的表達(dá)顯著增高，脂質(zhì)ROS水平也顯著增加，而GSH水平則顯著下降。而抑制miR-101-3p則上述結(jié)果相反。因此，這些結(jié)果表明miR-101-3p可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞鐵死亡。

此外，miR-101-3p mimics和TBLR1過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染會(huì)顯著反轉(zhuǎn)上述miR-101-3p mimics單獨(dú)處理帶來的改變，表明miR-101-3p/TBLR1軸可以共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞鐵死亡進(jìn)而貢獻(xiàn)腫瘤進(jìn)展。

圖5 miR-101-3p/TBLR1軸是因鐵死亡調(diào)節(jié)而產(chǎn)生的抗腫瘤作用

5、納米載體使miR-101-3p在體內(nèi)腫瘤治療中有效分布

納米基因載體可以形成納米級(jí)藥物攜帶治療性的核酸，其可保證治療性核酸在體內(nèi)治療時(shí)的穩(wěn)定性，進(jìn)而通過增強(qiáng)通透性和滯留效應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤組織分布。作者嘗試構(gòu)建納米基因傳遞和miR-101-3p的基因治療用于體內(nèi)腫瘤治療。作者用紅色熒光POPO3標(biāo)記miR-101-3p，如圖6A所示，納米載體組紅色熒光顯著增強(qiáng)，而單獨(dú)熒光質(zhì)粒組則很難部分至細(xì)胞中。使用NIFR，CY7染色納米載體后，將其通過尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，觀察到納米載體在腫瘤區(qū)域的顯著聚集分布（圖6B）。隨后收集這些腫瘤組織進(jìn)行病理觀察，如圖6C所示，與對(duì)照組相比，納米載體組的腫瘤細(xì)胞中觀察到顯著的熒光聚集。該體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接證明了體內(nèi)熒光染色觀察到的納米載體在腫瘤區(qū)域的聚集。總之，上述研究表明，納米載體可以有效地將質(zhì)粒攜帶到腫瘤區(qū)域，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)染。

圖6分子成像追蹤技術(shù)研究納米載體靶向腫瘤鐵死亡進(jìn)行體內(nèi)治療的可能性

6、miR-101-3p的納米載體抑制腫瘤生長(zhǎng)

基于上述研究事實(shí)，作者專注于利用這種納米載體來攜帶miR-101-3p mimics，并在體內(nèi)腫瘤治療實(shí)驗(yàn)中探究其治療效果。將腫瘤細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)，處理4周，然后用含有miR-101-3p mimic、miR- 101-3p inhibitor或NC的納米載體通過尾靜脈注射給裸鼠治療。如圖7A和7B所示，裝載miR-101-3p mimic的納米載體顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和體積，而裝載miR-101-3p inhibitor的納米載體則顯著促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)和體積。此外，miR-101-3p的表達(dá)支持了上述結(jié)果，在miR-101-3p mimic的納米載體組上調(diào)，在miR-101-3p inhibitor的納米載體組下調(diào)（圖7C）。

此外，還通過染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組小鼠腫瘤細(xì)胞的增殖，凋亡，細(xì)胞總ROS水平，使用WB檢測(cè)了增殖，凋亡和鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。如圖7D-7F所示，這些結(jié)果和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，miR-101-3p mimic的納米載體會(huì)抑制腫瘤生長(zhǎng)指標(biāo)，促進(jìn)鐵死亡指標(biāo)。

圖7 miR-101-3p的有效基因傳遞通過促進(jìn)鐵死亡在體內(nèi)對(duì)腫瘤產(chǎn)生治療作用

總之，miR-101-3p通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡抑制腫瘤生長(zhǎng)，本研究設(shè)計(jì)的納米基因載體策略可以恢復(fù)腫瘤中miR-101-3p的表達(dá)，這可能是一種潛在的治療多種腫瘤的有效技術(shù)。

參考文獻(xiàn)：

Luo Yifeng., Niu Gang., Yi Hui., Li Qingling., Wu Zhiqiang., Wang Jing., Yang Juan., Li Bo., Peng Yuan., Liang Ying., Wang Weiwei., Peng Zhenwei., Shuai Xintao., Guo Yu.(2021). Nanomedicine promotes ferroptosis to inhibit tumour proliferation in vivo. Redox Biol, 42(undefined), 101908. doi:10.1016/j.redox.2021.101908