結直腸癌 (CRC) 在世界范圍內普遍存在，其死亡率主要是由于其轉移到遠處的關鍵器官而造成的。外泌體-microRNA（miRNA）分泌已被表征為癌細胞間細胞間通訊的重要因素。 然而，癌癥分泌的 miRNA 與結直腸癌 (CRC) 轉移的特異性相關知之甚少。因此了解 CRC 轉移的確切分子機制對于確定新的診斷生物標志物和制定 CRC 患者的治療策略非常重要。目前，有作者對這一機制進行了研究，該研究于2021年6月發表在《Molecular Therapy-Nucleic Acids》，IF：8.886。

技術路線：

研究結果：

1. CRC 細胞外泌體的表征

作者分離從CRC 細胞表面脫落的各種囊泡，通過電子顯微鏡、納米顆粒大小電位分析和蛋白質印跡鑒定外泌體（圖1A-1C）。為了確定外泌體是否可以被 CRC 細胞內化，用熒光染料 PKH67 標記外泌體，然后將它們與 SW480 細胞共培養，結果顯示 SW480 細胞表現出高吸收效率（圖1D）。與 PKH67 標記的外泌體孵育 24 小時后，超過 90% 的 SW480 細胞對 PKH67 熒光呈陽性，表明外泌體被 SW480 細胞內化。

圖1 來自結直腸癌(CRC)細胞系的外泌體的特性

2. 轉移性CRC SW620細胞分泌的外泌體促進CRC細胞的遷移、侵襲和EMT

作者使用細胞系 SW480 和 SW620 作為實驗模型，通過CCK-8 在 24 小時、48 小時和 72 小時測定細胞活力。結果表明，SW480-exo 或 SW620-exo 細胞對細胞生長沒有顯著影響（圖 2A）。此外，平板集落形成分析顯示 SW480-exo 或 SW620-exo 細胞之間的生長沒有差異（圖 2B）。然而，來自轉移性 CRC SW620 細胞的外泌體通過 Transwell 測定顯著促進了 SW480 細胞的遷移和侵襲（圖 2C）。此外，與 SW480-exo 和對照組相比，SW620-exo 提高了 SW480 細胞的傷口愈合能力（圖 2D）。蛋白質印跡分析以確定與 EMT 相關的蛋白質的表達水平。結果表明，相對于 SW480-exo 處理，SW620-exo 處理顯著增加波形蛋白、纖連蛋白和 N-鈣粘蛋白的表達并降低 E-鈣粘蛋白的表達（圖 2E），表明源自轉移性 CRC 細胞的外泌體在 SW480 中誘導了 EMT。

圖2來自轉移性 CRC 細胞系 SW620 的外泌體促進 CRC 細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化 (EMT)

3. miR-335-5p 在來源于轉移性 CRC 細胞的外泌體中高表達

作者進行 miRNA 測序以確定 SW480-exo 或 SW620-exo 中的 miRNA 表達譜。結果發現 SW480-exo 和 SW620-exo 具有顯著不同的 miRNA 表達譜（圖 3A），并確定了 77 個 miRNA 的倍數變化大于 5（圖 3B）。通過定量 PCR，證實 miR-335-5p 在 SW620-exo 中的表達比在 SW480-exo 中更高（圖 3C）。并使用來自TCGA數據庫的 miRNA 和 mRNA 表達數據，證實了 CRC 中的 miR-335-5p 相對于正常樣本顯著升高（圖 3D），以及 miR-335-5p 高表達的病例的總體存活率較低（圖 3E）。為了探索 miR-335-5p 在 CRC 中的功能，作者對 miR-335-5p 高或低表達的 CRC 樣本中表達的基因進行了基因集富集分析 (GSEA) 分析。確定了兩種生物學途徑的顯著富集：Ras 蛋白信號轉導和 Ras 蛋白信號轉導的調節（圖 3F 和 3G）。這些結果表明SW620外泌體具有較高水平的miR-335-5p，miR-335-5p在CRC中的功能可能與Ras信號通路的激活有關。

圖 3 miR-335-5p 在 SW620-exo 中的表達顯著高于 SW80-exo

4. miR-335-5p通過靶向RASA1促進CRC細胞的遷移和侵襲

作者使用TargetScan、miRDB 和 miRTarBase miR-335-5p 三種生物信息學算法預測潛在的靶基因（圖 4A）。從 TCGA 下載的數據分析表明，RASA1 的表達與 CRC 患者的 miR-335-5p 水平顯著相關（圖 4B）。圖 4C 顯示了通過生物信息學分析確定的 RASA1 3' UTR 中的假定的miR-335-5p 靶位點。 使用野生型 (WT) RASA1 3' UTR 在 SW480 細胞中進行的熒光素酶報告實驗，結果表明轉染 miR-335-5p 模擬物后熒光素酶活性顯著降低（圖 4C）。 相比之下，突變 (mut) RASA1 序列的報告基因的熒光素酶活性不受 miR-335-5p 的影響（圖 4C），表明 miR-335-5p 直接靶向 RASA1 3' UTR 的特定區域。為了確定 miR-335-5p 對 RASA1 的影響，使用 Lipofectamine 3000 將 miR-335-5p 模擬物瞬時轉染到 SW480 和 SW620 細胞中。用定量逆轉錄酶 PCR (qRT-PCR) 和蛋白質印跡進行評估表明 mRNA RASA1 和蛋白質水平在模擬轉染細胞中顯著下調（圖 4D）。 此外，miR-335-5p 轉染增加了 Ras 蛋白的表達（圖 4E）。 miR-335-5p 的上調可能伴隨著 EMT 激活，如 SW480 和 SW620 細胞中波形蛋白表達增加和 E-鈣粘蛋白表達降低所證明的（圖 4F）。 此外，miR-335-5p 水平升高顯著促進遷移和侵襲，而用 miR-335-5p 抑制劑抑制 miR-335-5p 顯著抑制 CRC 細胞的遷移和侵襲（圖 4G 和 4H）。

圖 4 miR-335-5p 通過靶向 RASA1 抑制 CRC 細胞遷移、侵襲和 EMT

5. 外泌體傳遞的miRNA-335-5p通過靶向RASA1促進CRC細胞遷移、侵襲、EMT和轉移

作者用 miR-335-5p 模擬物或陰性對照 (NC) 轉染的 SW480 細胞的條件培養基中收集外泌體。使用 qRT-PCR 檢測這些外泌體中 miR-335-5p 的水平。結果顯示含有模擬物（miR-335-5p 模擬物-exo）的外泌體顯著促進了 SW480 和 SW620 細胞的遷移和侵襲（圖 5A 和 5B），并且還降低了 RASA1 蛋白表達并增加了 Ras 蛋白表達（圖 5C）。此外，miR-335-5p 模擬物-exo抑制 EMT，如上皮標志物 E-鈣粘蛋白的表達降低和間充質標志物波形蛋白的表達增加（圖 5D）。最后，用 miR-335-5p 模擬物-exo處理的細胞顯示出更強的體內轉移促進作用（圖 5E 和 5F），肺表面宏觀結節的數量急劇增加。這些結果表明，外泌體介導的 miR-335-5p 穿梭可能會加速 CRC 細胞的體外遷移和侵襲以及體內轉移，同時伴隨著 Ras 信號和 EMT 的激活。

圖5 外泌體傳遞 miRNA-335-5p促進CRC細胞侵襲、轉移和EMT，并降低RASA1水平

6. RASA1的上調消除了外泌體miR-335-5p對CRC細胞遷移和侵襲的促進作用

為了進一步確定 RASA1 在 CRC 細胞中的潛在功能，使用慢病毒載體建立了過表達 RASA1 的穩定 SW480 細胞系。 如圖 6A 和 6B 所示，在用表達 RASA1 的慢病毒載體（lenti-RASA1；SW480-RASA1）轉染的 SW480 細胞中，實時 PCR 和蛋白質印跡驗證了 RASA1 mRNA 和蛋白質的過表達。 在過表達 RASA1 的細胞中，Ras 和波形蛋白的蛋白質水平顯著下調，而 E-鈣粘蛋白上調（圖 6C）。 此外，與 SW480 載體對照相比，SW480-RASA1 的遷移和侵襲能力顯著降低（圖 6D）。

接下來研究 RASA1 是否參與了 CRC 細胞中外泌體 miR-335-5p 對遷移、侵襲和 EMT 的誘導。 蛋白質印跡分析顯示，miR-335-5p模擬物-exo增加了Ras和波形蛋白的蛋白水平，但降低了RASA1和E-鈣粘蛋白的蛋白水平； 對于 RASA1 過表達，觀察到這些蛋白質的反向表達趨勢（圖 6E）。 此外，RASA1 過表達逆轉了 miR-335-5p模擬物-exo誘導的 SW480 細胞遷移和侵襲（圖 6F）。 這些結果表明外泌體 miR-335-5p 可能通過靶向 RASA1 誘導遷移、侵襲和 EMT。

圖6 RASA1異位表達抑制CRC細胞遷移和侵襲，消除外泌體miR-335-5p對細胞遷移和侵襲的促進作用

結論：

該研究揭示了外泌體 miR-335-5p 在 CRC 轉移中的新功能，并闡明了外泌體包裹的 miR-335-5p 通過直接靶向 RASA1 促進 CRC 細胞侵襲、轉移和 EMT 轉化。 這些發現強烈表明外泌體 miR-335-5p 可能是一種預后生物標志物，并為解決 CRC 轉移提供有價值的治療策略。

參考文獻：

Sun X, Lin F, Sun W, Zhu W, Fang D, Luo L, Li S, Zhang W, Jiang L. Exosome-transmitted miRNA-335-5p promotes colorectal cancer invasion and metastasis by facilitating EMT via targeting RASA1. Mol Ther Nucleic Acids. 2021; 24:164-174. doi: 10.1016/j.omtn.2021.02.022