雖然目前circRNA在人類癌癥發展中的功能已有廣泛的研究，但是醫學界對其在鼻咽癌（NPC）中作用仍然知之甚少。該文發現circRNF13通過SUMO2的泛素化可抑制鼻咽癌的增殖和轉移。本文于2021年8月發表在《Molecular Cancer》IF: 27.401期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、CircRNF13在鼻咽癌臨床樣本中低表達

作者對NPC細胞進行高通量測序獲得cicRNA表達譜，總計鑒定到6153個circRNAs，并包括了5種類型的circRNA（圖1A）。其中豐度較高的circRNF13相對于非腫瘤的鼻炎上皮細胞（NPE），在NPC中顯著下調。circRNF13是有外顯子8和外顯子2反向剪切形成，在細胞核和細胞質中均有分布，并且可在RNase R處理下穩定存在。以上結果表明circRNF13可能影響NPC的進展。

圖1 CircRNF13在NPC中低表達

2、CircRNF13抑制NPC細胞的增殖遷移和侵襲

如圖2所示，在NPC細胞系HNE2和CNE2中，過表達circRNF13都會顯著抑制NPC細胞的增殖，減少G2/M的細胞比例，以及侵襲和遷移。但是干擾circRNF13的表達則有完全相反的結果。提示circRNF13抑制NPC的生物學功能。

圖2 CircRNF13抑制NPC的增殖、遷移和侵襲

3、在體內circRNF13抑制NPC的生長和轉移

如圖3所示，和體外實驗類似，過表達circRNF13會抑制NPC的腫瘤生長和肺轉移，而干擾circRNF13則逆轉這些結果。表明circRNF13在體內也可發揮抑制NPC生長的作用。

圖3 CircRNF13在體內抑制NPC生長和轉移

4、CircRNF13可能通過抑制糖酵解抑制NPC的遷移和侵襲

為了探究circRNF13的作用機制，作者對si-circRNF13細胞系進行了LC-MS/MS檢測，結果鑒定到294個差異表達蛋白，他們的IPA分析結果顯示主要富集與糖酵解途徑。這些結果暗示circRNF13可能在NPC中參與調節糖酵解途徑。

生化分析結果顯示，過表達circRNF13會抑制NPC細胞的葡萄糖攝取和乳酸生成（圖4A）。海馬實驗也表明過表達增加細胞的糖酵解能力，干擾則相反（圖4B）。通過檢測細胞內AMPK的水平監測糖酵解通路。研究表明當糖酵解被抑制，細胞內AMPK水平被磷酸化激活，激活的AMPK通過抑制mTOR會抑制蛋白合成和轉錄，進而抑制腫瘤生長和轉移。結果顯示，過表達circRNF13顯著增加了NOC細胞中AMPKα的磷酸化并下調mTOR水平，并進一步下調下游靶基因mTOR，pS6K和4EBP1的表達；而敲除circRNF13則有相反的效果（圖4C）。當加入糖酵解抑制劑2-DG后，敲除circRNF13不能下調AMPKα的磷酸化（圖4D）。此外，敲除circRNF13造成的NPC的增殖和遷移會被2-DG所廢除（圖4E-F）。以上結果表明circRNF13通過抑制糖酵解抑制NPC的遷移和侵襲。

圖4 CircRNF13抑制NPC細胞的糖酵解

5、CircRNF13通過促進GLUT1的泛素化抑制NPC細胞的糖酵解

為了探究circRNF13調控糖酵解機制，作者檢測了糖酵解通路上的代表性分子GLUT1，LDHA和HK2，結果發現只有GLUT1的蛋白水平在過表達circRNF13后顯著下調，而mRNA水平沒有改變（圖5A，B）。于是進一步研究GLUT1。作者推測circRNF13可能是通過影響GLUT1蛋白穩定性來調節糖酵解通路的，因此使用環己酰亞胺（CHX）處理NPC細胞在circRNF13過表達或敲除后。結果發現GLUT1的穩定性下降，且泛素化水平下降，以響應circRNF13的過表達，而敲除circRNF13后其穩定性增強且泛素化增加。因此，以上結果說明circRNF13可能通過介導GLUT1的降解來調節糖酵解通路的。

圖5 CircRNF13通過促進GLUT1泛素化抑制NPC細胞的糖酵解

6、CircRNF13直接結合SUMO2 mRNA的3’UTR穩定SUMO2

為了探究circRNF13調節GLUT1泛素化的機制，作者進行了LC-MS/MS，其中SUMO2引起了作者的注意。SUMO2類泛素化修飾（SUMOylation）是泛素化樣蛋白修飾成員可以調節蛋白降解通過泛素化途徑。并且研究表明SUMO2在NOC中是抑制糖酵解的。

于是探究circRNF13與SUMO2的結合關系。與預期一致，過表達circRNF13會在mRNA和蛋白水平誘導SUMO2的表達上調，干擾circRNF13則效果相反（圖6A-B）。生信分析揭示circRNF13和SUMO2的非編碼區存在結合位點。RNA pull-down顯示生物素標記的circRNF13可以下拉SUMO2的mRNA在NPC細胞中。上熒光素酶實驗表明過表達circRNF13會提高SUMO2的熒光素酶活性。以上數據表明circRNF13通過與SUMO2結合調節其表達。

圖6 CircRNF13直接結合并穩定SUMO2 mRNA，上調其表達

7、CircRNF13通過SUMO2促進SLUT1的泛素化

接下來探究circRNF13是否是通過SUMO2來促進SLUT1的泛素化的。利用anti-Flag-GLUT1抗體進行共免疫沉淀(Co-IP)實驗，驗證GLUT1與SUMO2蛋白之間的相互作用。在SUMOylation期間，UBC9是唯一可以直接識別底物并催化SUMO蛋白c端羧基與底物蛋白結合進行修飾的連接酶。Co-IP實驗揭示了GLUT1和UBC9之間的相互作用（圖7A-B）。免疫熒光也顯示SUMO2和GLUT1蛋白有共定位。WB顯示過表達circRNF13促進GLUT1的SUMOylation，敲低circRNF13抑制GLUT1的SUMOylation（圖7D）。此外，泛素化實驗表明，過表達SUMO2可加速GLUT1的泛素化，而當共轉染si-circRNF13和SUMO2過表達載體時，si-circRNF13可減弱SUMO2誘導的GLUT1泛素化水平（圖7E-F）。這些結果提示，circRNF13通過與SUMO2結合調控GLUT1泛素化。總之，circRNF13促進GLUT1的泛素化，抑制GLUT1的表達，從而抑制NPC細胞的糖酵解過程。

圖7 CircRNF13通過SUMO2促進GLUT1的泛素化

8、CircRNF13通過SUMO2抑制NPC的增殖和轉移

最后，作者進行了拯救實驗，如圖8A-D所示，抑制circRNF13會促進NPC的生物學功能，包括增殖，遷移和侵襲，但是過表達SUMO2會顯著挽救circRNF13敲除帶給NPC細胞的表型改變。免疫組化顯示，SUMO2在circRNF13過表達裸鼠腫瘤切片中低表達，而GLUT1則顯著高表達。以上證實circRNF13通過SUMO2抑制NPC的增殖和轉移。

圖8 CircRNF13通過SUMO2抑制NPC的增殖和轉移

總之，這些結果強調了circRNF13在鼻咽癌增殖和轉移中的重要意義。CircRNF13作為抑癌因子直接與SUMO2的3 -UTR結合，延長了SUMO2 mRNA的半衰期。上調SUMO2通過GLUT1的泛素化來促進GLUT1降解，這些通過抑制糖酵解調控AMPK-mTOR通路，最終導致鼻咽癌的增殖和轉移。

參考文獻：

Mo Yongzhen., Wang Yumin., Zhang Shuai., Xiong Fang., Yan Qijia., Jiang Xianjie., Deng Xiangying., Wang Yian., Fan Chunmei., Tang Le., Zhang Shanshan., Gong Zhaojian., Wang Fuyan., Liao Qianjin., Guo Can., Li Yong., Li Xiaoling., Li Guiyuan., Zeng Zhaoyang., Xiong Wei.(2021). Circular RNA circRNF13 inhibits proliferation and metastasis of nasopharyngeal carcinoma via SUMO2. Mol Cancer, 20(1), 112. doi:10.1186/s12943-021-01409-4