一類新的tsRNA標記作為胰腺癌診斷和預后的生物標志物
胰腺癌（PC）是全世界癌癥相關死亡率的第三大原因，大多數(shù)PC患者在確診后都已進展到晚期。因此對早期診斷和預后具有高敏感性和特異性的新型生物標志物的鑒定是目前提高PC治療效果的最佳策略。最近有研究發(fā)表一種tsRNA譜可以作為早期診斷和/或預測PC的臨床結果的指標，該研究于2021年7月發(fā)表在《Molecular Cancer》，IF：15.302。
技術路線：
主要結果：
為了探究血清tsRNA是否可以作為PC的新生物標志物，作者通過小RNA測序進行初步篩選，然后在個體基礎上進行qRT-PCR驗證。首先，從30例PC患者和30例健康對照者血清中提取RNA進行測序。長度分析顯示，兩組RNA的分布不同(圖S1A)。在檢測到的433個tsRNA和1121個miRNAs中，與健康對照組相比，PC組中tsRNA的變異更大(圖1A, B)，這表明tsRNA可能是檢測PC更敏感的生物標志物。分析結果顯示，與健康對照組相比，PC血清中有26個顯著差異的tsRNA (圖1 C)。采用絕對定量和相對比較的方法，在24名健康對照和24名PC患者的個體血清樣本中，驗證前10位上調tsRNA中的6個候選基因的差異表達。與健康對照組相比，PC血清中6種tsRNA中有4種顯著升高(圖1D)。相對比較分析顯示，6個tsRNAs中有2個(tRF-Pro-AGG-004, tRFLeu- CAG-002)在PC患者中顯著增加(圖S2)。然后評估了兩種tsRNA對風險評分預測的影響，ROC分析顯示，tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu –CAG-002具有更高的AUC(圖S3)。總之，tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002可以作為PC檢測的候選。
圖S1 PC患者和正常健康對照組血清中小RNA的分析
圖S3血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ROC曲線
2. 血清tsRNAs差異表達對胰腺癌的診斷價值
接下來，在兩家醫(yī)院的血清樣本中進一步分析了這兩種tsrna的表達。與對照組相比，PC血清中tsRNAs顯著升高。采用ROC分析確定2- tsRNAs譜的診斷價值。這兩種tsrna單獨在AUC下顯示出較高的診斷價值(tRF-Pro-AGG-004: 0.90;tRF-Leu-CAG-002: 0.78)和性能(tRF-Pro-AGG-004:敏感性72.5%，特異性98.8%;tRF-Leu-CAG-002:敏感性64%，特異性77.2%)(圖1F)。在聯(lián)合分析中，與單個tsRNA相比，2個tsRNA的特征具有更高的AUC和更高的性能 (圖1G)。ROC分析顯示，2-tsRNAs特征比CA19-9和CEA（臨床PC生物標志物CA19-9和CEA）具有更高的診斷潛力(圖1G)。有趣的是，2-tsRNAs組合對早期PC患者(I期和II期)的診斷準確率明顯更高，AUC為0.84，敏感性為75.0%，特異性為83.0%(圖1H)，優(yōu)于CA19-9(敏感性63.5%，特異性59.6%)和CEA(敏感性63.1%，特異性58.5%)。此外，在其他類型的疾病(包括HCC、BRC、NSCLC等)中檢測tRF-Pro-AGG-004和tRF-LEU-CAG-002的表達，表明聯(lián)合的2-tsRNAs特征在PC中具有一定的疾病特異性(圖1I)。這些結果表明，血清tRFPro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002即使在早期也可以作為診斷PC的新型生物標志物。
3. 血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的升高源于腫瘤組織
為了確定PC血清中兩種tsRNAs的高水平是否是由PC組織中的擾動引起的，首先檢查了獨立臨床隊列中相同患者的組織和配對血清中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的水平，并觀察到正相關(圖2A)。為了進一步探討PC細胞是否釋放出增加的tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002，在不同時間段的PANC1培養(yǎng)基中研究了tsRNAs的表達。作者發(fā)現(xiàn)它們的表達與細胞數(shù)量和培養(yǎng)時間成正比(圖2B)。此外，細胞中兩種tsRNAs抑制劑處理后，培養(yǎng)基中tsRNAs水平降低(圖2C)，說明培養(yǎng)基中的tsRNAs直接從PC細胞中釋放出來。tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu- CAG-002的定量顯示，與對照組小鼠相比，PC小鼠的腫瘤組織和血清標本中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu- CAG-002的表達顯著升高(圖2D)。此外，兩種tsRNAs的血清水平與腫瘤重量之間存在顯著正相關(圖2E)。綜上所述，這些結果表明，血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的升高源于腫瘤組織。
作者還檢測了循環(huán)tsRNA的存在形式，并分別從PC患者血清、PC小鼠血清和PANC1細胞培養(yǎng)基的外泌體和無外泌體上清中分離出總RNA。有趣的是，結果顯示，tRF-Pro-AGG-004在無外泌體的上清中高度富集，而tRF-Leu-CAG-002優(yōu)先存在于外泌體中(圖2F)。兩種循環(huán)tsRNA的不同形式表明了它們不同的作用和系統(tǒng)調節(jié)機制。
4. PC患者腫瘤組織中2個tsRNAs標記的預后潛力
傳統(tǒng)的病理分期系統(tǒng)在預測預后方面可能已經達到了極限，而新的分子生物標志物可能會增加價值。因此，作者通過標準流程的ISH分析對2個臨床PC隊列中的2 - tsRNAs表達進行檢查和評分。結果顯示，與正常組織相比，PC組織中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002顯著上調(圖S6)。當根據(jù)生存時間將患者分為較短生存組和較長生存組時，較短生存組的tsRNAs均顯著升高(圖2G, H, J)。設置ISH的最佳臨界值時(ISH分數(shù)>3為高，ISH分數(shù)<3低)，tRF-Pro-AGG-004高和/或tRF-Leu-CAG-002高的PC患者的預后明顯更差(圖2I, K)。這些結果提示，tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ISH評分可以作為預測患者術后生存時間的有價值的生物標志物。
圖2 tsRNAs在腫瘤組織升高作為預測PC患者生存時間的獨立指標
5. 胰腺癌中被血管生成素切割的tsRNAs增加
為了進一步探討這兩種tsRNAs產生的機制，利用IHC芯片檢測了60對PC腫瘤和正常組織中參與tsRNAs加工的主要酶，包括ANG和Dnmt2。34/60例(56.7%)PC患者ANG明顯升高，而Dnmt2在兩組間無顯著差異(圖3A，圖S7)。TCGA分析也得到了類似的結果(圖3B)。這些結果表明，腫瘤組織中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002上調可能是ANG切割增加所致。ANG較高的PC患者總生存時間明顯縮短(圖3C)。轉染ANG siRNA導致PC細胞和培養(yǎng)基中tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的減少(圖3D)。此外，在PC原位移植腫瘤模型中，使用體內優(yōu)化的RNAi去除ANG顯著降低了腫瘤和血清tsRNAs水平(圖3E-I)。這些結果表明，上調的tsRNAs可能是通過ANG的切割增加而產生的，ANG可能是PC治療的一個潛在靶點。
6. tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002在胰腺癌中的作用
一些tsRNAs可能在結構和功能上與miRNA相似，直接與靶mRNA結合，導致翻譯抑制。通過體內和體外實驗評估了兩種tsRNAs在胰腺癌中的功能意義。將感染的細胞皮下移植到六周大的裸鼠體內。細胞植入后30天評估腫瘤生長情況(圖3J,K)。與對照組相比，tsRNA過表達組移植瘤的重量或體積更高或更大(圖3L,M)。此外，EdU檢測顯示，tsRNAs模擬物加速了PANC1的增殖，而抑制劑則延緩了細胞的增殖(圖3N)。Transwell實驗表明，過表達tsrna促進細胞侵襲，而抑制兩種tsrna則抑制細胞侵襲(圖3O)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明這兩種tsRNAs在胰腺癌中起著腫瘤啟動子的作用。
總結：
首先在PC患者中發(fā)現(xiàn)了一種新的血清雙tsRNAs特征。然后，證明即使在早期血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002可以作為新的有前景的生物標志物用于PC診斷。此外，結果表明，腫瘤組織中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ISH評分可以作為預測患者術后生存時間的有價值的生物標志物。揭示了這兩種新的血清tsRNAs的起源、存在形式和潛在的生物學功能。需要進行隨機臨床試驗來評估雙tsRNAs標記在胰腺癌早期診斷和預后中的可能應用。
參考文獻：
Jin F, Yang L, Wang W, Yuan N, Zhan S, Yang P, Chen X, Ma T, Wang Y. A novel class of tsRNA signatures as biomarkers for diagnosis and prognosis of pancreatic cancer. Mol Cancer. 2021, 20(1):95. doi: 10.1186/s12943-021-01389-5