肺腺癌 (LUAD) 是最常見的非小細胞肺癌類型。然而，LUAD 腫瘤發生的潛在機制在很大程度上是未知的。N6-甲基腺苷 (m6A) RNA 甲基化在各種人類癌癥中的關鍵作用，包括肺癌。今天來講一篇關于m6A與肺癌的文章，題名為：The m 6 A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant function（IF=11.79）。

YTHDC2的抑制與LUAD中的腫瘤進展有關

為了評估m6A閱讀器在肺癌中的表達譜，通過 GEPIA 數據庫分析了已知的閱讀器，包括 YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、HNRNPA2B1、HNRNPC/G、eIF3A、FMR1 和 IGF2BP1/2。其中，與正常肺相比，LUAD 和 LUSC 中只有 YTHDC2 下調。然而，IGF2BP2 在 LUAD 和 LUSC 中差異表達。Oncomine 數據庫還顯示 YTHDC2 在 LUAD 中通常被下調。Kaplan-Meier 圖的分析進一步表明，較低的 YTHDC2 與 LUAD 中較差的總體生存率相關。這些結果使我們研究了 YTHDC2 在 LUAD 中的作用。

患者肺癌組織樣本中，與鄰近的正常組織相比，在腫瘤中觀察到YTHDC2 mRNA 和蛋白質的顯著下調。類似地，與 BEAS-2B 細胞相比，已建立的 LUAD 細胞系中的 YTHDC2 減少。組織芯片分析表明 YTHDC2 在 51% (98/192) 的 LUAD 患者中下調。值得注意的是，YTHDC2 的下調與更大的腫瘤直徑和更晚期的階段有關。表明 YTHDC2 抑制促進了 LUAD 中的腫瘤進展。

YTHDC2 通過其 m 6 A 閱讀域表現出抗腫瘤活性

為了在體內探索YTHDC2的 m 6 A 閱讀器功能，在有或沒有 m 6 A 識別 YTH 結構域的情況下實現了 YTHDC2 的肺過表達，并生成了基于 KP 和 GFP 標記的 KPY WT、KPY ΔYTH和對照 KPE 小鼠。除了強烈的 GFP 信號外，與感染后 25 周的 KPE 小鼠相比，YTHDC2 被證實在來自 KPY WT和 KPY ΔYTH小鼠的腫瘤中持續上調。，表明 AAV5 表達系統的持久效率。盡管YTHDC2無法阻止肺腫瘤發生，但腫瘤發生時間被延遲，壓倒性的肺腫瘤負荷被顯著抑制，KPY WT小鼠的存活時間比KPE小鼠和KPY ΔYTH小鼠長。

我們進一步研究了 YTHDC2 是否是人類 LUAD 細胞中的腫瘤抑制因子。選擇 H1975 和 H1299 細胞是因為它們分別在測試的 LUAD 細胞系中表現出最高和最低的 YTHDC2 表達。IB 檢測證實了 YTHDC2 的過表達和敲除效率。雖然在 H1299 細胞中YTHDC2 WT過表達后3D 球體的數量和大小以及異種移植物的腫瘤生長減少，但在 YTHDC2 ΔYTH過表達后未觀察到這些影響。相比之下，敲除 H1975 細胞中的 YTHDC2 會增加小鼠的球體形成和異種移植物生長。值得注意的是，當使用 YTHDC2 sg2-抗性（res）重建 YTHDC2 表達時，YTHDC2-sg2 在腫瘤發生中的積極作用得以恢復。因此，YTHDC2 通過其 m 6 A 閱讀域在 LUAD 中發揮腫瘤抑制功能。這些結果也解釋了為什么 Ythdc2 在鼠腫瘤中的顯著表達和 H1299 細胞中的 YTHDC2當突變體過表達時，沒有改變轉化表型。

YTHDC2 抑制胱氨酸攝取和下游抗氧化程序

通常在具有高致瘤特性的腫瘤中觀察到代謝活性。為了研究 YTHDC2 對代謝物的影響，進行了代謝組學分析，比較了具有低和高 YTHDC2 表達（的LUAD 標本。GSH 代謝是確定的前 20 條 KEGG 途徑之一。在顯著改變的代謝物中，與 YTHDC2高腫瘤相比，在 YTHDC2低腫瘤中觀察到胱氨酸增加了 3.975 倍。此外，觀察到 YTHDC2 與細胞內胱氨酸之間呈負相關。這些數據表明 YTHDC2 減少細胞內胱氨酸。

為了驗證 YTHDC2 是否降低了胱氨酸攝取，我們培養了具有高 (pHY#1-8) 或低 (pLY#1-8) YTHDC2 表達水平的原代患者來源的 LUAD 細胞。L- 14 C-胱氨酸攝取測定結果表明，YTHDC2 通過其 YTH 結構域抑制了 H1299 和 H1975 細胞產生的異種移植物、小鼠形成的 LUAD 和患者來源的 LUAD 細胞中的胱氨酸攝取。已顯示CHAC1 mRNA 水平的上調表明胱氨酸攝取受損。事實上，觀察到 YTHDC2 增加了CHAC1 mRNA 水平。胱氨酸-谷氨酸逆向轉運蛋白系統 Xc -通過谷氨酸的反向轉運導入胱氨酸。谷氨酸釋放測定結果顯示 YTHDC2 抑制谷氨酸釋放。這些結果表明 YTHDC2 通過抑制系統 Xc - 來損害胱氨酸攝取。System Xc -對氧化還原平衡和新陳代謝至關重要，以及YTHDC2 的 YTH 結構域對 H1299 和 H1975 細胞中GSH/GSSG 和 NAD + /NADH 比率的改變，進一步表明 YTHDC2 可能損害系統 Xc -功能。

受損的系統 Xc -功能與 GSH 水平降低有關。來自患者來源的 LUAD 細胞和小鼠腫瘤的數據表明 YTHDC2 確實降低了 GSH。為了研究下游的胱氨酸抗氧化劑是否補償了 YTHDC2 的抗腫瘤作用，給小鼠注射了 GSH 和 NAC，一種半胱氨酸前體。給予 NAC 和 GSH 的KPY WT小鼠肺中的腫瘤負荷顯著高于載體治療的對照小鼠，并且水平與 KPE 小鼠相似。有趣的是，與KPE 小鼠相比，GSH 和 NAC 給藥僅導致 KPY WT小鼠腫瘤中 GSH/GSSG 比率的顯著增加。該結果的一個潛在原因是 YTHDC2 損害系統 Xc -，我們提出系統 Xc -功能的損害可能對促進 GSH 及其除胱氨酸以外的原料，如半胱氨酸或其前體進入細胞。

正如之前的研究中所報道的，缺乏 GSH 導致脂質過氧化增加。因此，熒光探針（C11-BODIPY 581/591）用于測量小鼠 LUAD 中的氧化脂質。此外，作為脂質過氧化產物的 4-HNE 和 MDA 水平在 KPY WT的腫瘤中增加，但在 KPY ΔYTH 中沒有增加小鼠與 KPE 小鼠相比。值得注意的是，在 KPY WT小鼠中，NAC 和 GSH 補充劑可減少脂質過氧化并縮短存活時間。總體而言，這些結果表明YTHDC2的 m 6 A 讀取功能對于減少胱氨酸下游抗氧化程序至關重要

YTHDC2 抑制 SLC7A11 表達

雖然抑制系統 Xc -功能與 YTHDC2 受損的胱氨酸攝取有關，YTHDC2 如何調節系統 Xc -仍不清楚。SLC7A11，催化亞基，在維持系統 Xc -活性方面發揮著重要作用。使用 UALCAN 數據庫，我們發現與正常肺相比，LUAD 中的 SLC7A11 上調。此外，較高的 SLC7A11 導致 LUAD 患者的總生存期較短。值得注意的是，YTHDC2 與 LUAD 中的 SLC7A11 呈負相關。因此，SLC7A11 可能與 YTHDC2 的功能相反，以維持胱氨酸攝取。

接下來，研究了 YTHDC2 是否調節 SLC7A11。在 H1299 和 H1975 細胞中，SLC7A11 的蛋白質和 mRNA 水平都受到 YTHDC2 的負調控。在小鼠中，與來自 KPE 和 KPY ΔYTH小鼠的腫瘤相比，來自 KPY WT小鼠的腫瘤中的 Slc7a11 下調。此外，YTH 結構域是 YTHDC2 抑制 SLC7A11 表達的先決條件。

隨后，我們研究了 YTHDC2 是否通過 SLC7A11 抑制胱氨酸攝取。當 YTHDC2 在 H1299 細胞中過表達時，異位表達 SLC7A11 完全恢復了受損的胱氨酸攝取。相反，YTHDC2 缺失誘導的胱氨酸攝取被靶向 H1975 細胞中 SLC7A11 的 shRNA 逆轉。ATF4 和 NRF2 是SLC7A11轉錄的兩個關鍵轉錄因子。與 ATF4 不同，NRF2 無法上調 H1299 細胞中的 SLC7A11，這可能是由于 LUAD 單元格上下文特定的影響。值得注意的是，過表達 YTHDC2 仍然拮抗 ATF4 的作用。因此，YTHDC2 損害依賴于 SLC7A11 的胱氨酸攝取。

還研究了換著樣本中 YTHDC2 和 SLC7A11 的臨床相關性。與鄰近組織相比，YTHDC2 在腫瘤中被下調，而 SLC7A11 在腫瘤中被上調。此外，它們在腫瘤中呈負相關。

YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰減

進一步研究了通過 YTHDC2 調節 SLC7A11 表達的機制。因為 SLC7A11 的 mRNA 和蛋白質水平都受到 YTHDC2 的負調控，我們想確定 SLC7A11 的 mRNA 和蛋白質水平是否都被 YTHDC2 抑制。為了解決這個問題，首先研究了 YTHDC2 是否調節SLC7A1 1 mRNA。當 YTHDC2 在 H1299 細胞中過表達時，YTH 結構域在抑制SLC7A11啟動子活性方面沒有作用。敲除 YTHDC2 然后在 H1975 細胞中重建其表達也表明 YTHDC2 調節SLC7A11轉錄。然后，我們用泛轉錄抑制劑 ActD 處理 H1299 和 H1975 細胞，以檢查 YTHDC2 是否在轉錄被阻斷后調節SLC7A1 1 mRNA 的穩定性，發現 YTH 結構域對于 YTHDC2 縮短SLC7A1 1 mRNA的半衰期是必不可少的H1299 細胞。通過 CRISPR/Cas9 技術喪失 YTHDC2 功能，隨后在 H1975 細胞中重建 YTHDC2 進一步證實 YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰減。。刪除 EXOSC10 而不是 XRN2，減弱了 YTHDC2 對縮短SLC7A1 1 mRNA 半衰期的影響。，表明 YTHDC2 促進 3'-5' SLC7A1 1 mRNA 降解。在藥理學水平上，用 DEPC 和 RNasin 這兩種泛 RNase 抑制劑處理 H1299 細胞也阻斷了 YTHDC2 的功能。這些發現確立了 YTHDC2 在破壞LUAD 細胞中SLC7A1 1 mRNA 的穩定性中的作用。

YTHDC2 調節SLC7A1 1 mRNA 穩定性，控制 RNA 衰變是 m 6 A 甲基化的重要功能之一。。YTHDC2抑制SLC7A11的功能是否依賴于m 6 A甲基化仍然未知。在三個主要作者中，即 METTL3、METTL14 和 WTAP，與 H1299 細胞相比，僅發現較高的 METTL3 表達水平與 H1975 細胞中較高的整體 m 6 A 甲基化水平相關。METTL3增加H1299和H1975細胞中m 6A。在 H1975 細胞中敲低 METTL3 延長了SLC7A1 1 mRNA的半衰期，而在 H1299 細胞中過表達 METTL3 加速了SLC7A1 1 mRNA 降解。此外，H1299 細胞中降低的 METTL3 表達會阻止 YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰變，損害胱氨酸攝取并刺激脂質活性氧 (ROS) 的產生。表明 YTHDC2 在 LUAD 細胞中的作用是 m 6 A 依賴性的。

SLC7A1 1 mRNA 被 m 6 A 甲基化

為了揭示SLC7A1 1 mRNA 中潛在的 m 6 A 甲基化位點，在H1975細胞中 METTL3 敲低之前和之后進行了 MeRIP-seq。GGAC 基序在 H1975 細胞的m6A 位點高度富集，無論是否敲除METTL3。m6A 峰在靠近 mRNA 終止密碼子的 3' 非翻譯區 (3'UTR) 中尤為豐富。MeRIP-seq 揭示了一個推定的m6A 基序位于 3'UTR。該位點周圍的 m 6 A 富集與 m 6 A 甲基化水平相關。為了進一步確認SLC7A1 1 mRNA的 m6A 依賴性修飾，進行了 MeRIP-qPCR。在H1975細胞中敲除 METTL3 后，SLC7A1 1 mRNA 中的m 6 A 修飾在推定的 m 6 A 位點周圍顯著減少。相反，當 METTL3 在 H1299 細胞中過表達時，觀察到相反的結果。因此，我們提供了證據表明SLC7A1 1 mRNA 可以在 LUAD 細胞中被 m 6 A 甲基化。

盡管 YTHDC2 用作 m6A 閱讀器，但YTHDC2是否優先結合并識別 m 6 A 甲基化的SLC7A1 1 mRNA 尚不清楚。首先進行了評估SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。結果表明，通過在 H1299 細胞中過表達 METTL3來增加 m 6 A 甲基化水平促進了 YTHDC2 與SLC7A1 1 mRNA 的結合。相比之下，一旦 METTL3 在 H1975 細胞中被敲除，SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用就被顯著抑制。無論 METTL3 是過度表達還是被敲低，YTH 結構域的缺失都會阻止SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。接下來，我們使用合成的部分SLC7A11 3'UTR 探針進行了體外 RNA 下拉測定，并將它們與來自表達 HA 標記的 YTHDC2 WT和 YTHDC2 ΔYTH 的H1299 細胞的裂解物一起孵育。YTHDC2 WT，但不是 YTHDC2 ΔYTH，與含有未甲基化腺苷的SLC7A1 1 mRNA的 3'UTR相比，更優先結合含有 m 6 A 的mRNA。此外，YTHDC2 易于結合 m 6 A 共有基序 GGAC，這與位于推定的 m 6 A 位點內的相同，因為當 GGAC 被取代時，觀察到SLC7A11 3'UTR-YTHDC2 相互作用顯著減少一個隨機的 CCAG 主題。最后，進行了 RIP-qPCR 測定以評估 m6 A 甲基化是否調節細胞內SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。實際上，與 H1299 細胞相比，更高的整體 m 6 A 甲基化在H1975細胞中引起了更強的SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。從 METTL3 在 H1299 和 H1975 細胞中的功能獲得和喪失實驗中，我們還得出結論，細胞內SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用是由 m 6 A 水平決定的。這些數據表明YTHDC2優先結合m 6 A-甲基化的SLC7A1 1 mRNA。

然后，我們檢查了YTHDC2 是否通過假定的m6A 位點使SLC7A1 1 mRNA不穩定。我們克隆野生型（WT）SLC7A11 3'UTR和突變型（MUT）3'UTR的螢火蟲熒光素酶的下游pmirGLO 質粒中的編碼區。結果表明，僅過表達 YTHDC2 WT而不是過表達YTHDC2 ΔYTH 會降低H1299 細胞中SLC7A1 1 mRNA 的穩定性，而敲除 YTHDC2 可增加其在 H1975 細胞中的穩定性。然而，與 WT 3'UTR 相比，Mut 報告基因的這些影響減弱了。在檢查pmirGLO 質粒表達的外源F-Luc-SLC7A11融合 mRNA的 RNA 穩定性后，獲得了類似的結果。。總體而言，3'UTR的 m 6 A 位點對于 YTHDC2 破壞SLC7A1 1 mRNA 的穩定性至關重要。

具有 YTHDC2 抑制的 LUAD 對系統 X C -靶向治療敏感

為了評估 YTHDC2 抑制在 LUAD 中的重要性，患者樣本中隨機選擇了20 個 YTHDC2低LUAD，其中 50% 屬于腺泡亞型。。要了解YTHDC2的患病率較低的腺泡亞型，另一種群組＃2被吸收特定于腺泡亞型。在隊列#2（n = 100）中，與鄰近組織相比，腫瘤中的 YTHDC2 下調，并且 62%（62/100）的腺泡組織被歸類為 YTHDC2低與沒有這種表達模式的患者相比，YTHDC2低的腺泡 LUAD 患者的總生存期要短得多。進一步證明 YTHDC2 抑制可能對腺泡 LUAD 的腫瘤進展特別重要。

YTHDC2抑制SLC7A11; 因此，我們推測 SLC7A11 在腺泡 LUAD 中同時上調。事實上，這在隊列#2 中是正確的。最近，使用系統 X C -抑制劑。我們想知道哌嗪埃拉汀 (PKE) 是一種穩定的埃拉汀體內衍生物，是否對腺泡 LUAD 具有潛在的治療作用。此外，同時對索拉非尼進行了檢查。PDX 小鼠模型對于評估患者的治療敏感性很有價值。因此，來自 4 名不同腺泡 LUAD 患者的 PDX 模型被給予 PKE 和索拉非尼。由于小鼠傳代，未觀察到 YTHDC2 和 SLC7A11 的組織病理學和表達的顯著變化。與 DMSO 處理的對照相比，當給予 PKE 和索拉非尼時，觀察到顯著的腫瘤消退。此外，給小鼠服用PKE和索拉非尼也會導致腫瘤中MDA和4-HNE的顯著增加。表明誘導的脂質過氧化可能是抑制腺泡 LUADs 腫瘤發生的結果。

最后，我們招募了另外兩個隊列來驗證我們的結論。雖然第 3 組 LUAD 患者是從華北招募的，第 4 組也從中國上海招募，但時間范圍與第 1 組不同。與隊列#1 的觀察結果相似，MDA 和 YTHDC2 受到抑制，而與隊列 #3 中的鄰近組織相比，腫瘤中 SLC7A11 的 mRNA 和蛋白質水平均升高（n = 30），證實了 LUAD 中 YTHDC2 的抑制通過上調 SLC7A11 來防止脂質過氧化。在隊列#4（n = 20/每個階段）中，MDA 和 YTHDC2 呈負相關，而 SLC7A11 與階段正相關，表明 SLC7A11 升高可能是抑制 YTHDC2 以促進 LUAD 進展的關鍵