核磷蛋白(Nucleophosmin，NPM1)是急性髓系白血病(AML)中最常見的突變基因，會導致編碼的核仁蛋白(NPM1c⁺)發生異常胞漿易位。NPM1c ⁺維持一個獨特的白血病基因表達程序，以激活HOXA/B簇和MEIS1癌基因為特征，促進白血病發生。然而，NPM1c⁺控制這種基因表達模式促進白血病發生的機制仍在很大程度上未知。本文揭示了HOXBLINC lncRNA激活在NPM1c ⁺白血病中扮演促癌作用。HOXBLINC和其合作者MLL1是NPM1c⁺ AML的潛在治療靶點。本文于2021年3月發表在《Nature Communications》IF:14.919。

技術路線：

主要實驗結果：

1、HOXBLINC lncRNA在NPM1c ⁺白血病中特異性上調

HOX基因，特別是HOXA和HOXB聚類基因的上調不僅是AML發病的特點，也是其主要機制。HoxBlinc lncRNA已經被證明是在發育過程中激活前HoxB基因轉錄所必需的。為了確定HOXBLINC是否與HOXB基因一起在AML中異常表達，檢測了正常BMMNC細胞和CD34+陽性細胞，以及NPM1c ⁺AML病人中HOXBLINC lncRNA的表達，發現HOXBLINC lncRNA在NPM1c ⁺AML病人中顯著高表達，在TCGA數據發現一樣的結果（圖1A-B）。表明HOXBLINC lncRNA在NPM1c ⁺白血病中特異性上調。

2、HOXBLINC的缺失擾亂了NPM1c+介導的轉錄程序和白血病發生

隨后鑒定了NPM1c ⁺AML和NPM1c ^WTAML病人中的差異表達基因，與WT相比，有871個下調基因和980個上調基因，包括HoxBlinc和NPM1c+的特征基因HoxB2-5，HoxA7,9-11，Meis1，Runx1（圖1c）。然后，通過RNA-seq分析比較了對照組和HOXBLINCi細胞的全基因組轉錄組變化。一致地，NPM1c+細胞表現出HOXBLINC lncRNA和常見的NPM1c+ AML標記基因的高表達(圖1d)。有趣的是，在OCI-AML3細胞中抑制HOXBLINC顯著抑制了許多NPM1c+標志性基因的轉錄，如HOXB2-5、HOXA9-11、RUNX1和MEIS1(圖1d)。GSEA和GO分析顯示，HOXBLINC的缺失會影響NPM1突變、HOXA9通路、癌癥、細胞周期、細胞命運、髓樣細胞分化以及Wnt和JAK-STAT信號通路中涉及AML的通路和基因（圖1e-f）。此外，與對照組相比，HOXBLINC KD顯著抑制OCI-AML3細胞增殖（圖1g）。當把Dox誘導的HOXBLINC KD OCI-AML3克隆移植到NOD-scid IL2Rγnull (NSG)小鼠，然后進行Dox誘導或對照處理時，與未接受Dox處理的小鼠相比，Dox處理的受體小鼠的生存期顯著延長（圖1h）。并且HOXBLINC KD顯著增加了小鼠預后，以及腫瘤病理改變（圖1i-j）。因此，HOXBLINCKD降低了腫瘤負擔，并減弱了體內白血病進展，這可能是NPM1c+ AML患者的特異性。

圖1 HOXBLINC在NPM1c+ AML患者中被激活，HOXBLINC的缺失擾亂了NPM1c+介導的轉錄程序和白血病發生

3、HoxBlinc在造血中的轉基因表達導致小鼠的AML樣致死疾病

已有研究表明，小鼠造血干細胞(HSCs)中人源化NPM1c+敲入等位基因(NPM1c/+)的激活會導致Hox基因過度表達、增強self-real和骨髓增生擴大，以及遲發性AML的發展。由于NPM1c+激活HOXBLINC，而HOXBLINC對NPM1c+介導的轉錄程序和白血病發生至關重要，因此確定HOXBLINC的激活是否足以導致異常造血和類似于NPM1c/+小鼠的髓系惡性腫瘤非常重要。HoxBlinc在長期(LT)和短期(ST)造血干細胞中表達高，在祖細胞(MPP, CMP和GMP)中表達降低，除了B220+ B細胞，在成熟細胞系中進一步降低（圖2a）。HoxBlinc在造血中的表達模式提示該lncRNA可能在調控HSPC功能中發揮重要作用。為了研究HoxBlinc活化對體內正常造血和白血病發生的影響，構建了HoxBlinc轉基因(Tg)小鼠模型，在Vav1啟動子和增強子(HS321/45-vav載體)的控制下，將全長小鼠HoxBlinc cDNA插入小鼠基因組，以確保轉基因在造血系統中的特異性表達(圖2b)。獲得2只HoxBlincTg小鼠。將該轉基因插入到Tg第1系18q染色體上Bin1基因的內含子中(圖2c)。BM細胞中HoxBlinc RNA的表達水平分別是Tg Line #1和#2內源性HoxBlinc表達水平的18倍和3倍(圖2d)。

對HoxBlincTg (Line #1)小鼠隊列的監測顯示，1歲以內，67%的HoxBlincTg小鼠(15只中有10只)因病死或被殺，而WT小鼠(n = 12只)沒有死亡（圖2e）。與野生型相比，垂死的HoxBlincTg小鼠表現出體重減輕、肝脾腫大、淋巴結腫大以及腳墊和股骨蒼白（圖2f）。形態學上，May-Grünwald-Giemsa染色顯示母細胞明顯增加(圖2g，左)。BM細胞自旋制備也顯示髓系細胞占優勢，未成熟髓系前體增多(圖2g，右側)。骨髓組織切片的形態學評估顯示髓樣增生伴未成熟髓樣前體增多，以髓過氧化物酶(MPO)陽性表明髓樣來源（圖2h）。此外，HoxBlincTg的組織學評估顯示脾臟、肝臟和淋巴結切片正常器官結構扭曲，并有MPO陽性骨髓細胞浸潤（圖2h-i）。這些數據表明，與NPM1c/+小鼠相似，HoxBlinc過表達小鼠足以引起類似AML的異常血液學特征。

圖2 HoxBlinc轉基因過表達小鼠導致致死性AML

4、HoxBlinc基因表達增強HSC自我更新，擴大骨髓形成

NPM1c+促進HSC自我更新和髓細胞擴張的能力已被明確。為了進一步了解HoxBlinc在AML發病機制中的作用，研究了HoxBlinc過表達對HSPC功能的影響。HoxBlincTg BM細胞中Lin^- scale-1⁺c-Kit⁺ (LSK)細胞的比例明顯高于野生型小鼠，而Lin^- scale-1^- c-Kit⁺ (LK)細胞群與野生型小鼠相似（圖3a）。計算ST-HSCs LT-HSCs總數時，股骨和多能祖細胞(MMP)計算基于比例LSK內細胞群和BM多孔性，LT-和ST-HSCs池，但不是MPP明顯擴大，盡管只有ST-HSCs LSK內細胞的比例增加（圖3b）。當對LK細胞內的每個髓系祖細胞群進行分析時，HoxBlincTg小鼠中GMP的百分比顯著高于WT小鼠，但MEP/CMP細胞群的百分比低于WT小鼠（圖3c）。因此，HoxBlinc過表達導致HSPC池失調，導致體內造血系統向髓系傾斜。

接下來，通過體外復制、配對子細胞實驗和體內競爭移植研究了HoxBlinc過表達對造血干細胞自我更新和再生能力的影響。在HoxBlincTg LSK細胞中，連續4輪的復制電位均顯著高于WT細胞(圖3d)。使用WT和HoxBlincTg原始CD34?LSK細胞的配對子細胞檢測顯示，具有對稱自我更新能力的HoxBlincTg CD34?LSK細胞比例更高，而進行對稱分化或不對稱自我更新的細胞比WT減少（圖3e）。競爭移植實驗表明，HoxBlincTg BM細胞移植后，受體外周血中供體細胞(CD45.2+)嵌合率穩定上升，移植7個月后達到~80%，而WT BM細胞移植后小鼠外周血中CD45.2+細胞群保持在~50%（圖3f）。有趣的是，接受HoxBlincTg BM細胞的小鼠在移植后2.5-7個月死亡率更高(圖3g)。總體而言，HoxBlinc基因在小鼠中的表達增強了HSC的自我更新，并擴大了骨髓形成，導致AML樣疾病，與NPM1c/+小鼠中看到的表型相似。

圖3 HoxBlinc轉基因表達增強HSC自我更新，擴大骨髓形成

5、HoxBlinc的過表達通過提高HSPC⁺中增強子/啟動子染色質的可及性激活NPM1c+標記基因

為了進一步確定HOXBLINC是否是NPM1c+的下游介質，以維持HSPC中NPM1c+標記基因的激活，對8周齡小鼠的WT和HoxBlincTg LSK細胞進行了RNA-seq，總計鑒定到1281個差異表達基因（圖4a）。其中，上調的有718個，下調的有563個。值得注意的是，在NPM1c/⁺ vs . WT LSK細胞中，27.3%的上調基因和21%的下調基因基因重疊（圖4b）。GSEA分析HoxBlincTgv s. WT LSK細胞差異表達基因揭示了與NPM1c / +與WT LSK細胞相似的轉錄特征和富集通路，包括NPM1-mutated特征，HOXA9致癌途徑，HSC增殖，細胞命運的承諾，骨髓分化，Wnt和JAK-STAT信號通路（圖4c-d）。

由于HoxBlinc通過招募SETD1A和MLL1復合物，并在HoxB前位點組織活躍的染色質結構域，促進HoxB前基因的表達，NPM1c+或HoxBlincTg引起的HoxBlinc上調可以通過增強子/啟動子染色質可及性來激活其在HSPC中的靶基因。為了驗證這一點，使用WT、NPM1c/+和HoxBlincTg小鼠的LSK細胞進行了轉座酶可及染色質分析高通量測序 (ATAC-seq)。巧合的是，NPM1c/+和HoxBlincTg LSK細胞有相當一部分基因表現出啟動子可及性的增加(28.9%)或減少(24.3%)（圖4e）。此外，NPM1c+或HoxBlincTg使啟動子可及性增加的基因中有相當一部分也上調，這些基因包括NPM1c特征基因HoxB2-5、HoxA9-10、Meis1和Runx1，以及其他靶基因如Stat1和Cdr2（圖4f-g）。這些結果表明HoxBlinc lncRNA的過表達通過增強HSPC中增強子/啟動子染色質的可及性特異性激活NPM1c+標記基因。

圖4 HoxBlinc過表達通過增強LSK細胞啟動子染色質的可及性激活NPM1c+標記基因

6、HoxBlinc直接與靶基因結合，介導染色質相互作用，驅動HSPC中的基因調控網絡

CTCF邊界促進了受限拓撲相關域(TADs)內增強子/啟動子的相互作用。作者之前報道了后HOXA位點的CTCF邊界建立和維持活躍的TAD，以驅動后HOXA基因表達。為了研究HoxBlinc過表達是否會影響CTCF定義的HoxB位點前TAD域和增強子/啟動子調控網絡，使用高通量測序捕捉環狀染色體構象(4C-seq) 使用HoxB位點CTCF結合位點(cbs)作為HoxBlincTg與WT Lin?c-Kit+細胞（圖5a）。有趣的是，HoxBlinc過表達增強了這些由CBS5 /5和/或+43CBS介導的HoxB前位點內的長程相互作用（圖5b）。而+73Kb CBS (+73CBS)和HoxB13 CBS (CBS13)與前HoxB基因不互作，盡管+73CBS與CBS5/6和CBS8/9存在交互作用，但不受HoxBlinc過表達的影響（圖5b）。此外，HoxBlinc過表達也誘導了CBS4/5和/或+43CBS與HoxBlinc靶基因如Stat1、Crd2和后HoxA基因啟動子區域的長程相互作用，而非HoxBlinc靶基因HoxD（圖5c）。這些數據表明，HoxBlinc與CBS4/5和+43CBS協調，促進并維持與NPM1c+標記基因位點的長期染色質相互作用，從而激活它們。

為了完全理解HoxBlinc過表達調控HSPC造血轉錄程序的機制，進行了ChIRP-seq在WT和HoxBlincTg Lin ^- c-Kit⁺細胞中繪制基因組HoxBlinc結合位點。HoxBlinc的過表達顯著增加了其與HoxB前基因啟動子區域和其他反式靶點的結合，如Stat1、Cdr2、Wnt5a、Runx1和后HoxA基因（圖5d）。Lin^-c-Kit+細胞基因組中HoxBlinc結合位點的整體分布表明，HoxBlinc主要與非編碼區相互作用，包括基因間區、內含子和啟動子。值得強調的是，HoxBlinc的過表達顯著增加了其與啟動子和UTR的占用（圖5e）。整合來自WT和HoxBlincTg HSPC的ChIRP-seq、RNA-seq和ATAC-seq數據集顯示，大約74%的基因HoxBlinc結合增加表現在基因表達水平增加兩倍以上（圖5f），44.7%的基因表現出啟動子染色質可及性增強（圖5g）。這些數據表明，HoxBlinc直接結合造血特異性靶基因，主要是NPM1c+特征基因，并介導染色質的長程相互作用，驅動HSPC的基因調控網絡。

圖5 HoxBlinc直接與靶基因結合，介導染色質相互作用，驅動HSPC中的基因調控網絡

7、MLL1的募集對于HoxBlinc過表達介導的靶基因表達和HSPC功能異常至關重要

由于HoxBlinc招募SETD1A和MLL1復合物在小鼠ECS衍生的原始紅細胞祖細胞的HoxB位點組織活性染色質域。所以作者先證實了人類HOXBLINC與MLL1和SETD1A的相互作用。然后體內外研究SETD1A和MLL1在HoxBlinc過表達介導的HSPC功能異常和白血病發生中是否重要。然而，在HoxBlincTg LSK細胞中，敲除Mll1而非Setd1a能夠緩解HoxBlinc過表達介導的異常復制潛能（圖6a）。當使用表達慢病毒對照或shMll1的HoxBlincTg Lin c-Kit+細胞進行移植時，與表達HoxBlincTg Lin c-Kit+細胞的shScramble相比，mll1KD顯著延長了接受shMll1表達HoxBlincTg Lin c-Kit+細胞的受體的存活時間(圖6b)。而mll1KD也能很大程度上恢復HoxBlincTg小鼠中CD117+/CD11b+未成熟髓系細胞和GMPs的異常擴增以及貧血(圖6c, d)。這些數據表明Mll1 KD能夠緩解HoxBlinc過表達誘導的AML發展。

由于MLL1在HoxBlinc過表達介導的異常造血過程中至關重要，HSPC中HoxBlinc過表達可能通過增加MLL1募集來激活其靶基因，從而提高H3K4me3占用率，以促進增強子/啟動子染色質的可及性。為了證實這一點，使用WT和HoxBlincTg LSK細胞進行了MLL1和H3K4me3 ChIP-seq。ChIP-seq和CHIRP-seq聯合分析顯示HoxBlinc和MLL1的基因組結合位點存在高度重疊（圖6e-g）。令人驚訝的是，51.2%的基因HoxBlinc結合增加顯示MLL1招募增加，其中大部分(31.7%)也顯示H3K4me3占用增加，包括NPM1c+-標記基因，如前HoxB、后HoxA、Meis1和Runx1，以及其他造血基因，如Stat1和Cdr2（圖6e-g）。這些數據表明，HoxBlinc過表達通過增加MLL1的募集和隨后H3K4me3占用的增強來介導靶基因的表達。

圖6 MLL1的募集對于HoxBlinc過表達介導的靶基因表達和HSPC功能異常至關重要

總之，本文發現HOXBLINC過表達是驅動白血病發生的關鍵事件，通過控制MLL1招募、染色質結構域和啟動子的順式和反式表達，建立異常NPM1c+標記基因表達程序。因此，本研究不僅為HSC和NPM1突變的AML的生物學提供了分子視角，而且還為NPM1c+ AML的藥物靶點識別創造了獨特的機會。

參考文獻：

Zhu Ganqian., Luo Huacheng., Feng Yang., Guryanova Olga A., Xu Jianfeng., Chen Shi., Lai Qian., Sharma Arati., Xu Bing., Zhao Zhigang., Feng Ru., Ni Hongyu., Claxton David., Guo Ying., Mesa Ruben A., Qiu Yi., Yang Feng-Chun., Li Wei., Nimer Stephen D., Huang Suming., Xu Mingjiang.(2021). HOXBLINC long non-coding RNA activation promotes leukemogenesis in NPM1-mutant acute myeloid leukemia. Nat Commun, 12(1), 1956. doi:10.1038/s41467-021-22095-2