現今研究表明tRNA-derived small noncoding RNAs（sncRNAs）主要分為兩類：tRNA halves (tiRNAs)和fragments (tRFs)。前者在人類實體腫瘤中的的生物學功能吸引了越來越多的關注，但是其在腫瘤發生中的生物學機制仍知之甚少。tiRNAs和剪切相關蛋白之間的相關作用更是為未可知。本研究首次發現一個5’-tRNA halves，即tiRNA-Gly通過與RBM17結合誘導可變剪切進而促進乳頭狀甲狀腺癌（PTC）的增殖和遷移。本文于2021年7月發表在影響因子7.068的《Journal of Experimental and Clinical Cancer Research》期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、人PTC組織中tRFs和tiRNAs的表達

為了鑒定人PTC組織中的tRFs和tiRNAs，收集3對PTC癌組織和癌旁組間，用于高通量測序，其結果比對至tRNA library GtRNAdb文庫，并從中去除線粒體tRNA。最終累計獲得1723個tRNA片段，其中594個片段只存在于腫瘤組織，136個只存在于癌旁組織（圖1A-B）。成分分析顯示，腫瘤中tiRNAs的數量遠超癌旁組織，而tRFs則主要存在于癌旁（圖1C）。火山圖可以看出5個在腫瘤組織中顯著上調的tRNA片段：5’-tiRNA-Gly-GCC，5’-tiRNA-Lys-CTT，5’-tiRNA-Glu-CTC，5’-tRF-Val-CAC，pre-tRNA-Ser-TGA (Fig. 1D)。圖1E顯示tRNA片段1260，1293，1297和1385明顯來源于腫瘤組織。tRNA片段1293和1297都是5’-tiRNA-Gly-GCC剪切自tiRNA-Gly-GCC的不同部分的。tRNA片段1260切割自tRNA-Glu-CTC，tRNA片段1358切割自tRNA-Lys-CTT。

為了驗證tRFs&tiRNA-Seq數據，作者檢測了91對PTC組織和癌旁組織中tRFs&tiRNA的表達，其中，tiRNA-Gly在人類PTC組織中的表達水平最高，并顯著高于癌旁組織（圖1F-G）。WB顯示，tiRNA-Gly在PTC腫瘤中蛋白表達顯著高于癌旁，但是tRNA-Gly的表達在癌和癌旁中無顯著差異（圖1H）。總之，tiRNA-Gly可能在PTC的進展中起致癌作用。

圖1人PTC組織中tRFs和tiRNAs的表達

2、在小鼠模型中，tiRNA-Gly調節PTC細胞的增殖和遷移，并影響腫瘤生長

首先檢測了tiRNA-Gly在3株PTC細胞系中的表達，如圖2A所示，K1細胞系中tiRNA-Gly的表達顯著低于BCPAP和TPC-1細胞系。因此，對于功能獲得性實驗，合成帶有5’磷酸末端的tiRNA-Gly轉染至K1細胞系（圖2B）。結果發現，與對照組相比，tiRNA-Gly顯著促進K1細胞的增殖和遷移（圖2C-D）。對于功能缺失實驗，在BCPAP和TPC-1細胞系中轉染siRNA干擾tiRNA-Gly的表達，結果顯示細胞的增殖和遷移都顯著下降（圖2E-G）。體內實驗得出了類似的結果，干擾tiRNA-Gly表達導致腫瘤體積減小，Ki67表達下降。總之，體內體外實驗都表明tiRNA-Gly是PTC的惡性因子。

圖2 tiRNA-Gly在體內外調節PTC細胞的惡性活動

3、tiRNA-Gly直接與RBM17相互作用，調控RBM17在PTC細胞中的表達

為了探究tiRNA-Gly在促癌中分子機制，作者合成了生物素標記的tiRNA-Gly及其反義序列，進行RNA pull-down實驗，進而挖掘K1細胞中與tiRNA-Gly相互作用的蛋白。結果發現了一個50KD左右大小的條帶，選擇經質譜測定肽數> 3和獨特肽數> 3的蛋白，獲得了5個可能的tiRNA-Gly相互作用蛋白，其中RBN17通過了WB驗證（圖2B）。RIP實驗也證實tiRNA-Gly在RBM17抗體組富集（圖3C）。進一步RIP實驗表明，tiRNA-Gly在RBM17全長序列中顯著富集，但在UHM截斷后的序列中富集度顯著下降，表明tiRNA-Gly和RBM17的相互作用依賴UHM（圖3D）。此外，與tiRNA-Gly的相互作用促進了K1細胞RBM17從細胞質轉移到細胞核，雖然tiRNA-Gly主要定位于細胞質，但同時導致K1細胞胞質RBM17蛋白水平降低，核RBM17蛋白水平升高（圖3E-G）。因此，這些研究表明tiRNA-Gly與RBM17的UHM結合促進RBM17的核轉運。

鑒于以上結果，作者想進一步探究tiRNA-Gly與RBM17作用的分子結果。結果顯示，tiRNA-Gly可提高總RBM17蛋白的水平，但是不影響RBM17的mRNA水平（圖3H-I）。隨后，用蛋白質合成抑制劑環己胺(CHX)處理細胞，tiRNA-Gly轉染后增加了K1細胞內源性RBM17蛋白的半衰期，而β-actin作為對照（圖3J）。此外，蛋白酶體抑制劑MG132處理后，內源性RBM17在轉染tiRNA-Gly的K1細胞中的積累量大大高于轉染siRNA-NC的K1細胞，表明tiRNA-Gly抑制了蛋白酶體依賴性的PTC細胞中RBM17的降解（圖3K）。此外，tiRNA-Gly的過表達顯著抑制了泛素化RBM17的水平（圖3L）。綜上所述，tiRNA-Gly可以穩定RBM17蛋白通過泛素/蛋白酶體依賴性降解。

圖3tiRNA-Gly直接與RBM17結合，調控RBM17在PTC細胞中的表達

4、RBM17促進PTC細胞的增殖和遷移，并在PTC腫瘤組織中升高

接下來探究RBM17在PTC細胞中的功能，RBM17的mRNA和蛋白表達在K1細胞系中遠低于TPC-1和BCPAP細胞，其表達趨勢類似于tiRNA-Gly（圖4A-B）。于是構建了RBM17過表達的K1細胞系，發現其增殖和遷移曾麗顯著增加（圖4C-F）。RBM17敲低則效果相反（圖4G-J）。此外，RBM蛋白表達在PTC腫瘤組織中顯著高于癌旁組織（圖4K）。以上結果表明RBM17的作用和tiRNA-Gly相似，在PTC中促進腫瘤進展。

圖4 RBM17促進PTC細胞的增殖和遷移

5、RBM17的衰減抑制了tiRNA-Gly對PTC細胞的影響，RBM17在PTC組織中的表達受tiRNA-Gly的調控

隨后，作者分別檢測了人PTC組織中tiRNA-Gly高表達和tiRNA-Gly低表達的組織樣本中RBM17的表達水平，結果發現與預期一致，tiRNA-Gly高表達組RBM17的表達也顯著高于tiRNA-Gly低表達組（圖5A）。進行了類似于拯救實驗，即過表達tiRNA-Gly組，敲除RBM17組，以及過表達tiRNA-Gly的同時敲除RBM17組，結果表明，tiRNA-Gly過表達+siRBM17同時處理可以部分消除單獨處理時引起的TPC-1和BCPAP細胞增殖和遷移的改變（圖5B-C）。體內實驗表明，tiRNA-Gly敲低導致RBM17的表達急劇性下降（圖5D）。總之，tiRNA-Gly對PTC增殖和遷移的作用依賴于RBM17。

圖5 tiRNA-Gly與RBM17之間的關系

6、tiRNA-Gly通過RBM17調節增殖或遷移相關基因的選擇性剪接

由于RBM17是一種參與mRNA選擇性剪接的剪接體蛋白，研究tiRNA-Gly在與RBM17結合時是否調節下游基因的選擇性剪接將是一項有趣的研究。對過表達tiRNA-Gly后的K1細胞系進行RNA測序，所有的選擇性剪切事件如6A所示，外顯子跳躍（cassette外顯子）占37.67%，A5SSs剪接占6.78%，A3SSs剪接占4.99%，備選第一外顯子(AltStart)剪接占18.19%，備選末端外顯子（AltEnd）剪接占18.74%，互斥事件（MEXs）占5.12%，內含子保留剪接（IR）占8.51%。外顯子跳躍顯然是tiRNA-Gly誘導的最頻繁的選擇性剪接事件。MAP4K4、POSTN、HACE1、DPP9和BRCA1是外顯子跳躍導致表達變化最大的基因。tiRNA-Gly誘導了MAK4K4第16外顯子的跳躍，POSTN第21外顯子的跳躍，HACE1第8外顯子的跳躍，DPP9第21外顯子的跳躍和BRCA1第13外顯子的跳躍（圖6B）。如圖6C-D所示，升高的tiRNA-Gly誘導了MAP4K4一個截斷型(NM_4834.4)的mRNA水平，降低了一個長型(NM_1242560.1)的mRNA水平，而下調的RBM17則起相反的作用。重要的是，RBM17的敲除阻斷了由tiRNA-Gly誘導的MAP4K4截斷變體(NM_4834.4)的增加，表明tiRNA-Gly誘導的選擇性剪接依賴于RBM17。

MAP4K4是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，可以通過磷酸蛋白MEKK1激活MAPK通路。構建pCMV-NM_4834.4和pCMV-NM_1242560.1質粒，分別轉染K1細胞，并通過qRT-PCR驗證了其轉染效率（圖6E）。這兩種變異顯著增強了K1細胞的增殖和遷移。而截斷型(NM_4834.4)比長型(NM_1242560.1)對增殖和遷移的影響更強（圖6F-G）。此外，MEKK1、MKK4、JNK、MEK、ERK的總磷酸化水平未發生改變，而NM_4834.4和NM_1242560.1兩種變體轉染組的磷酸化水平均高于對照組。更重要的是，與NM_1242560.1相比，NM_4834.4對磷酸- MEKK1、MKK4、JNK、MEK、ERK的影響更強，這表明MAP4K4中第16外顯子的剪切影響了MAPK通路下游蛋白的磷酸化（圖6H）。體內小鼠模型結果證明，注射si-tiRNA-Gly組移植瘤中磷酸化蛋白水平明顯降低，而總蛋白水平與生理鹽水組相比沒有變化（圖6I）。這些結果表明，RBM17介導的tiRNA-Gly誘導的MAP4K4第16外顯子剪接可增強PTC細胞的增殖和遷移，并對MAPK通路下游蛋白進行磷酸化。

圖6 tiRNA-Gly通過RBM17調控MAP4K4 mRNA的選擇性剪接

總之，本文闡明了tiRNA-Gly結合RBM17的UHM結構域并促進其易位，導致RBM17蛋白增加，從而誘導PTC細胞中靶基因的選擇性剪接，最終促進腫瘤進展。

圖7 理論模型示意圖

參考文獻：

Han Litao., Lai Hejing., Yang Yichen., Hu Jiaqian., Li Zhe., Ma Ben., Xu Weibo., Liu Wanlin., Wei Wenjun., Li Duanshu., Wang Yu., Zhai Qiwei., Ji Qinghai., Liao Tian.(2021). A 5'-tRNA halve, tiRNA-Gly promotes cell proliferation and migration via binding to RBM17 and inducing alternative splicing in papillary thyroid cancer. J Exp Clin Cancer Res, 40(1), 222. doi:10.1186/s13046-021-02024-3