人類人臍帶來源的間充質干細胞（hUC-MSCs）移植被證實是治療系統性紅斑狼瘡（SLE）的有效方法，但是詳細的潛在機制仍不明確。轉運miRNAs可能是MSCs交流其它細胞的方法。Sirt1是一種NAD依賴的去乙酰化酶，通過去乙酰化p53來防止細胞衰老。本研究旨在探討在MRL/lpr狼瘡小鼠模型中，hUC-MSCs是否通過miRNA調節Sirt1/p53來影響脾CD4+ T細胞的衰老。本文于2021年1月發表在《Theranostics》IF：8.597期刊上。

技術路線

主要實驗結果

1、hUC-MSCs減輕緩解MRL/lpr小鼠的疾病進展

為了評估對MRL/lpr小鼠狼瘡綜合征的治療作用，從17周齡開始用5 × 10⁵ hUC-MSCs或PBS治療MRL/lpr小鼠，并在21周齡時處死所有小鼠(圖1A)。與PBS處理的小鼠相比，hUC - MSC處理的小鼠的腎臟病變明顯減少(圖1B)。此外，與PBS處理的MRL/lpr小鼠相比，hUC-MSCs處理后小鼠的脾臟重量和蛋白尿明顯降低 (圖1C - D)。hUC - MSCs治療組的血清anti-dsDNA抗體水平較低，但未達到統計學水平 (圖1E)。數據表明hUC-MSCs改善MRL/lpr小鼠的狼瘡疾病。

圖1 hUC-MSCs減輕緩解MRL/lpr小鼠的疾病進展

2、hUC-MSCs增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細胞的衰老通過Sirt1/p53信號

作者推測hUC-MSCs治療MRL/lpr小鼠的潛在機制可能是通過增強CD4+ T細胞的衰老來抑制其積累。為了驗證這一點，作者從脾細胞懸液中分離出單核細胞，然后純化CD4+ T細胞用于RNA和蛋白質制備。測量了p21和p16水平作為早衰的標記物。結果顯示與WT對照組相比，p21和p16的mRNA和蛋白質水平在MRL/lpr小鼠中顯著降低，與此同時，與接受PBS處理的MRL/lpr小鼠相比， p21和p16的mRNA和蛋白表達在hUC-MSCs治療組中顯著增加 (圖2A-C)。研究還發現，與WT小鼠相比，MRL/lpr脾臟CD4+ T細胞的Sirt1表達水平升高，在Lys-379位點的p53乙酰化水平降低，而hUC-MSCs治療可以通過降低Sirt1水平、增加p53水平和p53乙酰化水平來逆轉這一變化(圖2C - E)。總之，上述結果提示，MRL/lpr小鼠脾臟CD4+ T細胞的衰老可能是有缺陷的由于Sirt1/p53的信號改變導致，這可能導致CD4+ T細胞的過度增殖。因此，hUC-MSCs的臨床作用可能與脾CD4+ T細胞衰老通路的恢復有關。

圖2 hUC-MSCs治療使MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細胞的衰老標記物在體內恢復正常

3、hUC-MSCs在體外增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細胞的衰老通過Sirt1

在體內實驗的同時，在體外測定了hUC-MSCs對T細胞衰老的影響。MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細胞與hUC-MSCs以不同比例(CD4+ T細胞:MSCs: 1:1、10:1、50:1)共培養48 h。結果發現hUC-MSCs呈劑量依賴性方式顯著上調p21和p16的水平，但下調Sirt1的水平 (圖3A-C)。此外，細胞衰老的調節并不依賴于細胞與細胞之間的接觸，用transwell系統分離培養的CD4+ T細胞和MSCs時也發現了類似的結果(圖3D - F)。這些數據表明，可溶性因子介導了hUC-MSCs對MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細胞衰老的調節作用。

圖3 hUC-MSCs體外增加脾CD4+ T細胞衰老標志物

4、Sirt1是在MRL/lpr小鼠中hUC - MSCs介導的CD4+ T細胞衰老所必須的

接下來，檢測了Sirt1是否是hUC-MSCs促進MRL/lpr脾CD4+ T細胞衰老所足夠和必要的。研究發現，使用Sirt1抑制劑- EX527預處理MRL/lpr小鼠的CD4+ T細胞后，Sirt1的表達減弱，p21和p16的表達和p53的乙酰化水平均增加了 (圖4A)。相反地，用Sirt1的選擇性激活劑SRT1720預處理MRL/lpr小鼠的CD4+ T細胞后，可以抑制hUC-MSCs誘導的衰老(圖4B)。綜上所述，這些數據表明Sirt1是hUC-MSCs增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細胞衰老的關鍵介質。

圖4 Sirt1是hUC-MSCs增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T細胞衰老的中介物

5、hUC-MSCs調節MRL/lpr小鼠脾CD4+T細胞Sirt1/p53信號通過miR-199a-5p

文獻報道在癌癥和自身免疫疾病中，hUC-MSCs能夠將miRNAs轉移到周圍的細胞。因此，作者考慮miRNAs是否可能參與hUC - MSCs介導的對脾CD4+ T細胞中Sirt1的表達調控。使用在線軟件Target scan識別了10個miRNA，這些miRNA被預測靶向Sirt1。qPCR分析顯示，在這10個miRNAs中，只有miR-199a-5p的表達在MRL/lpr脾CD4+ T細胞中顯著降低(圖5A)。此外，miR-199a-5p是hUC-MSCs處理后唯一表達增加的miRNA(圖5A)。事實上，miR-199a-5p mimic不僅可以提高MRL/lpr脾CD4+ T細胞中miR-199a-5p的水平，降低Sirt1的表達(圖5B-C)，而且還可以提高衰老標志物p21、p16和乙酰化p53的表達水平(圖5D)。相反，miR-199a-5p抑制劑處理可提高WT小鼠脾CD4+ T細胞中Sirt1的表達(圖5E)，并降低衰老標志物p21, p16和乙酰p53水平(圖5F)。最后，與MRL/lpr相比，hUC-MSCs可增加miR-199a-5p的產生，表明hUC-MSCs是miR-199a-5p來源的關鍵調控因子 (圖5G)。在transwell系統中，hUC-MSCs與MRL/lpr脾CD4+ T細胞共培養48 h后，細胞內miR-199a-5p升高，Sirt1基因表達降低，CD4+ T細胞中衰老標志物的表達水平恢復，而miR-199a-5p抑制劑處理后仍處于抑制狀態(圖5G-I)。總的來說，這些數據表明hUC-MSCs通過miR-199a-5p介導的Sirt1下調和隨后p53去乙酰化的減少，增加了脾臟CD4+ T細胞的衰老。

圖5 hUC-MSCs誘導的miR-199a-5p可增加MRL/lpr脾CD4+ T細胞衰老

6、MiR-199a-5p改善MRL/lpr小鼠疾病

接下來，在體內評估了miR-199a-5p對MRL/lpr小鼠的影響。17周齡MRL/lpr小鼠每4天注射20 nmol miR-199a-5p agomir或對照(agomir nc)，共4周(圖6A)。末次注射后48 h處死小鼠，分離脾臟CD4+ T細胞。與對照組相比，miR-199a-5p agomir處理組顯示miR-199a-5p水平升高(圖6B)， Sirt1表達降低(圖6C)，衰老標志物p21和p16的表達顯著上調(圖6D)。這些數據表明hUC-MSCs通過miR-199a-5p增加MRL/lpr脾CD4+ T細胞衰老。

圖6 MiR-199a-5p agomir處理增加MRL/lpr脾CD4+ T細胞的衰老

接下來，研究系統給予miR-199a-5p agomir是否能挽救MRL/lpr小鼠的狼瘡表型。與agomir nc組相比，miR-199a-5p agomir處理組脾臟和淋巴結明顯縮小(圖7A-B)，血清中anti-dsDNA抗體、IgG水平下降(圖7D-E)。血清ANA水平有下降趨勢(圖7C)。miR-199a-5p agomir處理組的腎損傷，表現為尿蛋白下降（圖7F），腎小球增大和細胞增生減少(圖7G)，外周毛細血管袢中IgG沉積減少(圖7h)。綜上所述，這些數據表明hUC-MSCs移植通過miR -199a-5p介導的Sirt1信號下調從而增加脾CD4+ T細胞的衰老，改善MRL/lpr小鼠的疾病表型。

圖7 MiR-199a-5p agomir治療可改善MRL/lpr小鼠的疾病表型和免疫紊亂

參考文獻：

Cheng Tao., Ding Shuai., Liu Shanshan., Li Yan., Sun Lingyun.(2021). Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell therapy ameliorates lupus through increasing CD4+ T cell senescence via MiR-199a-5p/Sirt1/p53 axis. Theranostics, 11(2), 893-905. doi:10.7150/thno.48080