2021年5月，北京生物納米技術工程研究中心，國家納米科技中心，中國科學院大學未來技術學院，中國人民解放軍總醫院第五醫學中心乳腺癌科和中國人民解放軍總醫院第二醫學中心檢驗科團隊合作在Nature communications（IF=12.121） 雜志上發表了文章“Protein analysis of extracellular vesicles to monitor and predict therapeutic response in metastatic breast cancer”。此報道探索EV蛋白標記物在MBC診斷、治療反應監測和使用TAS平臺的預后預測中的效用。設計了一種機器學習算法基于8個乳腺癌相關EV蛋白 marker的表達水平來識別EV signature。EV signature提供了較高的準確性來區分MBC與非轉移性乳腺癌(NMBC)和健康供體(HD)，并在培訓、驗證和前瞻性隊列中監測MBC治療反應。EV signature也與接受治療的MBC患者的無進展生存期(PFS)相關。

轉移性乳腺癌(MBC)是一種異質性疾病，包括多個不同的亞型，仍然是世界范圍內女性癌癥死亡的主要原因之一。對于MBC患者，實時監測和預測治療反應對于最佳個性化治療方案至關重要。雖然組織活檢已被用于MBC的診斷，但其侵襲性帶來了風險和發病率，患者在進展時可能沒有足夠的組織可供4。計算機斷層掃描(CT)串行成像在監測治療反應時敏感性降低，不能用于預測疾病進展。因此，迫切需要可靠的、無創的MBC診斷、監測和預后工具。

通過以微創和可重復的方式分析循環腫瘤相關生物標志物，血液檢測為MBC管理提供了一個有吸引力的替代方案。癌抗原15-3 (ca15 -3)是MBC監測中最廣泛使用的血漿/血清生物標志物，但其反應僅在一半的患者中與疾病反應相一致。循環腫瘤細胞(CTCs)和循環腫瘤DNA (ctDNA)的定量和遺傳特征與腫瘤負荷監測的放射學測量具有良好的一致性，可預測MBC患者的疾病進展和生存。然而，由于外周血中ctc和ctDNA的豐度較低，ctc和ctDNA的分析往往需要大的采樣量和復雜的方法才能達到滿意的靈敏度。

腫瘤來源的細胞外囊泡(EVs)最近作為一種重要的循環生物標志物出現在癌癥診斷中。EVs結合蛋白已被證明在BC進展和轉移的關鍵過程中發揮重要作用，包括腫瘤血管化，靶向治療耐藥性，基質重塑，免疫逃逸和轉移前生態位形成。因此，血液中EV蛋白標記物的連續取樣可能有助于MBC的診斷和監測，但仍有待臨床隊列研究的發現。

離心分離EV，缺乏超靈敏和特異性的檢測方法，不受非囊泡污染的干擾。為了直接應對上述挑戰，我們之前開發了一種直接、敏感、經濟有效的熱電泳適體傳感器(TAS)來測定癌癥患者血清EV的表面蛋白譜，而不需要預先分離EV。TAS的工作原理是依賴于大小依賴的熱電泳富集(103倍)適配體結合EV，產生放大的熒光信號，其強度指示EV表面蛋白的表達水平。應用機器學習算法，定義了7種蛋白質標記物的EV簽名，用于6種不同癌癥類型的早期檢測和分類。

技術路線：

一、熱泳適體傳感器（Thermophoretic aptasensor ）用于EV蛋白標記物的敏感分析

A-C. TAS平臺用于分析ev上的特異性蛋白，具有臨床可行性(圖1)。臨床血漿樣本(1 L，)與cy5偶聯的適配體孵育2小時，使適配體能夠與靶EV蛋白結合(補充表2和3)。使用適配體而不是抗體進行蛋白檢測具有更高的熱穩定性和成本效益。然后，將孵育后的樣品進行10分鐘的局部激光加熱，以獲得大小相關的ev熱泳積累(模式尺寸約為100 nm)，以放大適體結合ev的熒光信號。

D. 小尺寸(幾納米大小)的可溶性蛋白不能被TAS積累和檢測，因為它們的耐熱性較弱.

從ev衰竭血漿(樣本i)中發出的熒光信號很弱，與加入可溶性蛋白如ca15 -3 (25 U mL 1)、ca125 (35 U mL 1)或CEA (5 ng mL 1)(樣本ii)的ev衰竭血漿中的熒光信號相似。

相比之下，在樣品iii中觀察到熒光強度增加了4倍，該樣品iii是通過將來自未治療MBC患者(2 109 mL 1)的血漿ev注入樣品ii中制成的(圖1d)。

E.   TAS可以檢測EV蛋白標記物，而不受可溶性對應物的干擾。TAS對ev的檢出限為3.8 ×10⁷ mL ^-1 (LoD，高于空白值3個標準偏差)，是ELISA的10²倍。

F.   G. 通過測量不同BC細胞系(BT-474、SK-BR-3和MDA-MB- 231)和良性乳腺上皮細胞系(MCF-10A)上8種蛋白標記物的表達水平來表征TAS的性能。不同細胞系ev的數量用NTA定量，實驗中ev的數量相同(10¹⁰ mL ^-1).

二、乳腺癌患者的EV蛋白譜

A.   B. 在EV為基礎的癌癥診斷中，收集了36例MBC患者搶救治療前、21例NMBC患者手術治療前和66例年齡匹配的HD患者的123份血漿樣本。8種蛋白標記物在血漿ev上的表達模式由TAS檢測。熱泳積累后，適體標記EV的熒光圖像反映了MBC或NMBC患者的8種EV標記物水平高于HD患者.

C.D MBC和NMBC患者EV蛋白標記物表達均存在顯著異質性。PrecisionRecall Curves (PRC)顯示，EV上的ca15 -3和EpCAM對BC和HD具有較高的區分能力.

E.F只有58.3%的MBC患者(21 / 36)和14.3%的NMBC患者(3 / 21)顯示血漿CA 15-3水平升高。此外，我們的數據顯示任何一對EV蛋白標記物之間的相關性較弱(Pearson中值相關系數r = 0.31，圖2f)，以及EV上血漿ca15 -3和ca15 -3之間的相關性較弱(r = 0.29，圖2f)

三、建立EV^DX signature用于MBC診斷

為了提高EV在區分MBC、NMBC和HD組方面的性能，我們利用機器學習方法來編譯所有EV蛋白標記物譜.

A.   B. EV^DX signature,  代表了通過線性判別分析(LDA, Supplementary Software)識別的 CA 15-3, CA 125, CEA, HER2, EGFR, PSMA, EpCAM, 和VEGF 信號。

C.EV^DX signature在三個類別上的總體準確率為91.1%.

D.8個EV蛋白標記的未加權和(sum)與EV^DX標記相比，總體準確性較低，為79.7% (95% CI = 71.5 86.4%)(補充表6 8)。分級聚類分析未發現MBC患者按轉移部位進行分離(圖3d)。

E.   MBC肺轉移患者EVs中EGFR的表達較高.

F.   在MBC患者中，針對腫瘤大小的EV簽名顯示出與3到5個最大可測量病變的腫瘤大小之和有良好的相關性。在NMBC患者中，EVTS特征也與原發腫瘤大小相關.

四、監測MBC治療反應的EV^M signature

評估了在治療14個周期后從MBC患者中收集的112份血漿樣本中EV蛋白譜監測治療反應的能力

A.   總結了部分緩解(PR, n = 18)、穩定(SD, n = 17)和進展(PD, n = 10)患者(RECIST, version 1.1) EV蛋白標記物表達水平的相對變化(ΔIntensity) .

B.   C. EV^M signature 定義為 LDA對8個標記ΔIntensity的加權和以及顯示的曲線下面積(AUC)為0.9429。通過受試者工作特征(ROC)分析區分PD和PR/SD的準確性為88.9% (95% CI = 76.0 96.3%)。

C.   驗證組包括患者血漿樣本MBC保持40%,維生素與簽名實現了AUC為0.9066

A-C.在35個血漿樣本的前瞻性隊列中，使用訓練過的LDA模型生成的EVM簽名在PD (n = 7)和PR/SD (n = 20)之間的區分準確率達到了85.2% (95% CI = 66.3 95.8%).

D-E.在培訓、驗證和前瞻性隊列中，當應用于不同的BC亞型時，EVM簽名在對治療反應進行分類方面表現出相似的性能(AUC = 0.9444，激素受體陽性(HR +)的95% CI = 0.8681 1.0000;人表皮生長因子受體2陽性(HER2 +)的AUC = 0.8674, 95% CI = 0.7307 1.0000;三陰性乳腺癌(TNBC)的AUC = 0.9026, 95% CI = 0.7662 1.0000.

五、MBC縱向監測的EV^M signature

在縱向研究中，我們比較了EV^M特征和血漿ca15 -3在監測至少有三個治療點的MBC患者對系統治療的反應方面的表現。
在不同的BC亞型中，EVM特征比血漿ca15 -3能更好地捕捉腫瘤負荷的變化。

PR (P124)在0 ~ 2時EVM信號水平下降，而血漿ca15 -3濃度略有升高。對于HER2 + MBC患者(P112)和轉移性TNBC患者(P45)伴有PD的患者，EVM特征水平升高。

在PD發生時血漿ca15 -3濃度保持不變甚至下降。血漿CA 3和治療反應之間的一致性為80%時觀察到的最大血漿CA 3水平高于閾值的兩倍(50 U mL ^-1)，而一致性下降到61.8%時最大血漿CA 3水平was< 50 U mL ^-1

六、EV^P信號用于預測MBC無進展生存

研究人員對59例正在接受治療的MBC患者的EV蛋白譜預測臨床結果的性能進行了研究

A. 在Kaplan Meier分析中(log-rank檢驗:P = 0.028)，高水平(中位數以上)的EVP特征(LDA對8個標志物的基線強度加權和)與較差的無進展生存期(PFS)顯著相關(圖7a)。EVP值較低時，中位無進展生存期為475天。

B-I.血漿ca15 -3在同一隊列中沒有顯示預后價值(log-rank檢驗:P = 0.23;單因素Cox回歸:HR = 0.5, 95% CI = 0.2 1.6, P = 0.239;多因素Cox回歸:HR = 0.7, 95% CI = 0.2 2.5, P = 0.6176;補充圖6)。我們還注意到，最好的EV蛋白標記物PSMA單獨與PFS相關，且具有統計學意義(log-rank檢驗:P = 0.015)，并作為PFS的獨立預測因子(單因素Cox回歸:HR = 4.0, 95% CI = 1.2 13.1, P = 0.0237;多因素Cox回歸:HR = 4.1, 95% CI = 1.2 14.1, P = 0.0277)。