導(dǎo)語：免疫檢查點(diǎn)阻斷療法已證明對(duì)多種癌癥類型具有良好的臨床效果。程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）是免疫檢查點(diǎn)，然而，由于耐藥性以及用于患者分層的生物標(biāo)志物不足，僅少數(shù)患者從單藥治療中獲益，在很大程度上限制了臨床效應(yīng)。這里，小編帶大家領(lǐng)略下小分子化合物的在耐藥方面的獨(dú)特魅力。

參考文獻(xiàn)：TYRO3 induces anti–PD-1/PD-L1 therapy resistance by limiting innate immunity and tumoral ferroptosis （IF=11.864）

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1. TYRO3高表達(dá)與抗PD-1/PD-L1治療患者的預(yù)后不良相關(guān)

建立腫瘤小鼠體內(nèi)耐藥模型，將4T1乳腺癌細(xì)胞接種到BALB/c小鼠的乳腺脂肪墊中，用抗PD-1（抗mPD-1）抗體治療，發(fā)現(xiàn)親代4T1(4T1-P)腫瘤對(duì)抗mPD-1治療有反應(yīng)，腫瘤生長(zhǎng)減少。相反，耐藥的4T1(4T1-R)腫瘤對(duì)抗mPD-1無反應(yīng)。使用市售的RTK抗體陣列系統(tǒng)與4T1-P或4T1-R細(xì)胞的裂解物雜交，發(fā)現(xiàn)4T1-R細(xì)胞中TYRO3、EPHB2、FLT3和TRKA表達(dá)或磷酸化水平高于4T1-P細(xì)胞，TYRO3的增加最高。在接受抗PD-1抗體治療的黑色素瘤患者的生存數(shù)據(jù)中，較高的TYRO3表達(dá)水平與較短的總生存期相關(guān)，表明TYRO3表達(dá)與抗PD-1耐藥相關(guān)。TYRO3較高的表達(dá)與多種癌癥類型的較差預(yù)后相關(guān)。

檢測(cè)TYRO3基因拷貝數(shù)與細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗腫瘤活性的相關(guān)性，CD8 + T細(xì)胞水平與高表達(dá)TYRO3基因的患者的生存期延長(zhǎng)無關(guān)，但確實(shí)介導(dǎo)了低TYRO3基因拷貝數(shù)患者的生存期延長(zhǎng)，表明TYRO3降低細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗腫瘤作用的觀點(diǎn)。

為進(jìn)一步確定TYRO3和抗PD-1治療結(jié)果之間的相關(guān)性，分析接受抗PD-1治療的黑色素瘤患者RNA-Seq數(shù)據(jù)中TYRO3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)耐藥腫瘤患者的TYRO3表達(dá)水平顯著高于腫瘤有反應(yīng)的患者。Western blot分析也驗(yàn)證了TYRO3，p-TYRO3在4T1-R克隆中的表達(dá)增強(qiáng)，說明TYRO3對(duì)配體刺激有反應(yīng)。為進(jìn)一步確定TYRO3和抗PD-1/PD-L1耐藥性在各種癌癥類型中是否普遍相關(guān)，我們研究了29例繼續(xù)接受抗PD-1/PD-L1治療患者的治療結(jié)果。抗PD-1/PD-L1治療耐藥患者的TYRO3表達(dá)水平高于對(duì)治療有反應(yīng)的患者。

綜上所述，患者腫瘤組織中TYRO3的高表達(dá)和磷酸化與抗PD-1/PD-L1治療的耐藥性相關(guān)。

2. TYRO3使腫瘤細(xì)胞對(duì)抗PD-1治療耐藥

在同系BALB/c小鼠模型中比較了Tyro3過表達(dá)(Tyro3-OE)和4T1-P細(xì)胞對(duì)抗mPD-1治療的反應(yīng)。在荷4T1-P腫瘤的小鼠中，抗mPD-1治療顯著減少腫瘤的生長(zhǎng)，并延長(zhǎng)了生存期。這些結(jié)果表明，盡管4T1-P腫瘤對(duì)抗mPD-1治療有反應(yīng)，Tyro3的過表達(dá)促進(jìn)了這些腫瘤的耐藥性。為進(jìn)一步確定在4T1-R耐藥細(xì)胞中抗PD-1/PD-L1耐藥是否需要TYRO3，敲除4T1-R細(xì)胞(TYRO3–/–)中的TYRO3。荷瘤Tyro3敲低細(xì)胞的小鼠對(duì)抗mPD-1治療敏感，腫瘤生長(zhǎng)顯著減少，小鼠存活時(shí)間更長(zhǎng)。這些結(jié)果證明TYRO3在抗PD-1/PD-L1耐藥中的重要作用。

為理解TYRO3在抗PD-1/PD-L1耐藥中的機(jī)制作用，從4T1-P、TYRO3-OE、4T1-R和TYRO3–/–細(xì)胞中提取RNA進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析。2種耐藥細(xì)胞系Tyro3-OE和4T1-R之間的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化高度相似，變化的重疊百分比較高，表明Tyro3在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗PD-1/PD-L1治療耐藥中的作用。來自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的黑色素瘤患者TYRO3基因的通路分析也顯示TYRO3表達(dá)與PD-1/PD-L1癌癥免疫治療通路呈正相關(guān)，與T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)相關(guān)通路（CTL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和死亡受體信號(hào)），炎癥反應(yīng)相關(guān)通路（Th1活化、Th2活化、NF-κB信號(hào)）呈負(fù)相關(guān)。HMGB1是一種損傷相關(guān)分子模式分子，由嗜鐵細(xì)胞釋放，我們發(fā)現(xiàn)HMGB1信號(hào)與TYRO3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。以上表明，TYRO3在抗PD-1/PD-L1耐藥中的作用，并表明TYRO3有利于抗炎TME。

3. TYRO3通過抑制鐵死亡和腫瘤TME，誘導(dǎo)抗PD-1/PD-L1耐藥性。

為探究TYRO3在TME中的功能，首先評(píng)估了TYRO3-OE 4T1和4T1-P腫瘤之間免疫學(xué)特征的整體變化。免疫細(xì)胞譜分析發(fā)現(xiàn)在CD45-腫瘤細(xì)胞中，Tyro3過表達(dá)與PD-L1或caspase-3無關(guān)，Tyro3-OE腫瘤中M1樣巨噬細(xì)胞水平降低，M1/M2比值下降，提示腫瘤表達(dá)的Tyro3促進(jìn)M1～M2巨噬細(xì)胞極化。用TYRO3-OE BT549細(xì)胞或TYRO3-OE和TYRO3–/–4T1腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基孵育THP1單核細(xì)胞或骨髓源性巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證TYRO3的體外抗炎功能。RNA-Seq發(fā)現(xiàn)VEGF在耐藥細(xì)胞系4T1-R和Tyro3-OE中表達(dá)上調(diào)，TYRO3-OE BT549細(xì)胞的條件培養(yǎng)基CM顯著降低M1標(biāo)記物的表達(dá)，增加M2標(biāo)記物的表達(dá)，加入VEGFR抑制劑完全消除TYRO3對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。這些結(jié)果表明TYRO3通過上調(diào)VEGF降低M1/M2比值，從而促進(jìn)原瘤TME。

在TYRO3-OE 4T1腫瘤細(xì)胞中，阻斷鐵死亡的基因上調(diào)（Slc40a1、Slc7a11、Slc3a2、Gpx4、Fth1和Blvrb），而增強(qiáng)鐵死亡的基因下調(diào)（Slc5a1、Tfrc）。在接受抗PD-1治療的黑色素瘤患者中，阻止脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的分子SLC3A2與TYRO3顯著共表達(dá)。抗PD-1治療后，Tyro3-OE CD45-腫瘤細(xì)胞的脂質(zhì)ROS水平低于4T1-P CD45-腫瘤細(xì)胞，而加入抗PD-1顯著增加4T1-P腫瘤細(xì)胞的脂質(zhì)ROS，但不增加Tyro3-OE腫瘤細(xì)胞的脂質(zhì)ROS，表明Tyro3抑制抗PD-1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞鐵死亡。在體外用鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin和鐵死亡抑制劑ferrostatin 1(Fer-1)處理4T1-P和Tyro3-OE 4T1細(xì)胞。與親代細(xì)胞相比，Tyro3過表達(dá)抑制了鐵死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。當(dāng)Fer-1阻斷鐵死亡時(shí)，Tyro3過表達(dá)抑制誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的脂質(zhì)ROS。Tyro3缺失增加了誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化，Fer-1消除了這些作用。這些結(jié)果表明TYRO3對(duì)于保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受鐵死亡至關(guān)重要。

NRF2是阻斷鐵死亡的關(guān)鍵介質(zhì)，TYRO3過表達(dá)的293T細(xì)胞中NRF2轉(zhuǎn)錄活性增加。TAM激酶下游的PI3K/AKT信號(hào)通路可增加NRF2轉(zhuǎn)錄活性，TYRO3-OE介導(dǎo)的NRF2轉(zhuǎn)錄激活被AKT抑制劑MK2206消除。這些結(jié)果表明TYRO3通過AKT/NRF2軸抑制鐵死亡。
吞噬細(xì)胞對(duì)瀕死細(xì)胞的清除依賴于對(duì)凋亡細(xì)胞暴露的“吃我信號(hào)”的識(shí)別。磷脂酰絲氨酸(PS)是一種關(guān)鍵的“吃我”分子，可與橋接分子結(jié)合，如TAM激酶配體蛋白S(Pros1)和Gas6。Pros1在與PS結(jié)合時(shí)同時(shí)激活TYRO3。Pros1處理4T1和PY8119腫瘤細(xì)胞可抑制erastin誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用，表明凋亡細(xì)胞的Pros1“吃我”信號(hào)可以通過TYRO3抑制腫瘤細(xì)胞鐵死亡。

綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明TYRO3抑制腫瘤細(xì)胞鐵死亡，并通過降低M1/M2比值支持原瘤TME。此外，腫瘤細(xì)胞可能利用鄰近瀕死細(xì)胞的Pros1“吃我”信號(hào)，通過激活TYRO3，抑制鐵死亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。

4. 抑制TYRO3可增強(qiáng)鐵死亡，使耐藥腫瘤對(duì)抗mPD-1治療敏感

TYRO3抑制劑LDC1267處理4T1-R細(xì)胞，有效降低了TYRO3磷酸化、，增加腫瘤細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化，而在Tyro3-/-細(xì)胞中不存在該作用，表明抑制TYRO3可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞鐵死亡。荷4T1-R腫瘤的小鼠腹腔注射抗mPD-1、LDC1267或其組合，聯(lián)合給藥顯著降低了腫瘤生長(zhǎng)，并延長(zhǎng)小鼠生存期。此外，腎功能和肝功能的生化指標(biāo)均在其正常范圍內(nèi)，證明聯(lián)合給藥在動(dòng)物中耐受良好。這些結(jié)果表明靶向TYRO3聯(lián)合抗PD-1有可能克服抗PD-1/PD-L1耐藥性，且毒性水平相對(duì)較低。

結(jié)論：TYRO3抑制腫瘤細(xì)胞鐵死亡，通過促進(jìn)M1到M2極化有利于原腫瘤TME，在抗PD-1治療期間促進(jìn)腫瘤存活。