病理上，脊髓損傷(SCI)后血脊髓屏障(BSCB)破裂導致大量周圍巨噬細胞浸潤到損傷區域，并在新生血管周圍聚集。M1極化的巨噬細胞在SCI過程中起著至關重要的作用。今天小編給大家介紹于2020年3月發表在影響因子為9.986的“Redox Biology”上的文章“Exosomal miR-155 from M1-polarized macrophages promotes EndoMT and impairs mitochondrial function via activating NF-κB signaling pathway in vascular endothelial cells after traumatic spinal cord injury”。本研究旨在探討M1極化的骨髓源性巨噬細胞(M1-BMDMs)對血管內皮細胞的影響及其機制。在本研究中，我們發現SCI后巨噬細胞浸潤可通過傳遞外泌體miR-155促進血管內皮細胞內內膜結構和損害線粒體功能，從而加重BSCB完整性破壞，miR-155隨后通過抑制SOCS6誘導的p65降解，激活NF-κB通路。

技術路線

結果

1）脊髓損傷后，BSCB隨著巨噬細胞浸潤和TJs破壞而破壞

脊髓損傷后，BSCB的完整性被破壞，如圖1A和B所示，在脊髓損傷中可見EB染色明顯，而假手術組未見EB染色，脊髓中EB染色含量也明顯增加。此外，在BSCB破壞的同時，我們發現大量巨噬細胞浸潤損傷區血管周圍(圖1C)，以M1極化為主，表現為CD68+和iNOS+(圖1C，1D)。此外，脊髓損傷后的病變區域可見明顯的血管新生，這可能是缺氧微環境所致；然而，TJs和血管的熒光染色顯示，與非損傷區相比，損傷區ZO-1和Occludin與CD31的共位較少(圖1E和F)。脊髓損傷后TJs蛋白水平隨時間顯著降低(圖1G)。考慮到脊髓損傷后浸潤的M1極化巨噬細胞與病變區域的血管存在相互干擾，我們推測M1極化巨噬細胞可能對脊髓損傷后的血管內皮細胞發揮重要作用，損害BSCB的完整性。

2）M1-BMDMs來源的外泌體加重了bEnd.3 細胞的EndoMT

我們評估了M1-BMDMs對bEnd.3細胞的影響。結果表明，M1-BMDMs條件培養基(M1-CM)顯著降低了bEnd.3 細胞TEER值(圖2A)，并增加通透性(圖2B)。此外，TJs蛋白熒光染色顯示，M1-CM處理顯著降低了bEnd.3 細胞膜ZO-1和Occludin的表達(圖2C和D)。為了進一步研究M1- BMDMs是否通過外泌體破壞血管內皮細胞的TJs，我們使用外泌體分泌抑制劑GW4869預處理M1- BMDMs。我們發現，加入GW4869部分逆轉了M1-CM誘導的TEER值的下降(圖2A)，滲透率增加(圖2B)；GW4869也逆轉了TJs蛋白熒光強度下降的趨勢(圖2C和D)。相應的，TJs蛋白表達水平也出現了類似的結果(圖2E)。有趣的是，通過對脊髓切片中的α-SMA和CD31進行共染色，我們發現損傷部位的共定位比未損傷部位更多(圖2F和G)。M1-CM顯著改變bEnd.3 細胞形態，分枝減少，胞體拉長(圖2H)。此外，M1-CM暴露顯著降低了CD31的表達，并強烈增強了EndoMT標記物膠原I、III和α-SMA在bEnd.3 細胞中的表達(圖2I)。然而，GW4869可以部分扭轉這些影響。綜上所述，外泌體可能介導巨噬細胞和血管內皮細胞之間的相互作用，并可能是巨噬細胞誘導血管內皮細胞 EndoMT的原因。

3）M1-BMDMs來源的外泌體上調ROS水平，損害bEnd.3 細胞的線粒體功能

已有研究表明，ROS與BSCB中斷有關，調節ROS水平在促進中樞神經系統損傷后功能恢復中起著至關重要的作用。基于之前的結果，我們研究了M1-BMDMs和ROS在bEnd.3 細胞中的關系。流式細胞術分析表明，M1-CM處理可顯著提高bEnd.3 細胞中ROS水平。GW4869可以部分逆轉這種增加(圖3 A和B)。此外，與M1-CM孵育后，線粒體超氧化物水平顯著升高，GW4869部分消除線粒體超氧化物水平(圖3C和D)。如圖JC-1染色所示，加入M1-CM后線粒體電位顯著降低，GW4869部分恢復線粒體電位(圖3E和F)。M1-CM處理使線粒體長度縮短、腫脹，線粒體破碎的細胞比例明顯增加。然而，GW4869可以部分逆轉線粒體形態變化(圖3G和H)。此外，M1-CM暴露顯著降低了氧化磷酸化的生物標志物OCR(圖3I)。基礎呼吸，ATP產生，呼吸能力，呼吸逆轉在添加M1-CM后顯著減少，而GW4869部分緩解了這一影響(圖3J)。

4）M1-BMDMs來源的外泌體在體內阻礙脊髓損傷后的運動功能恢復和破壞BSCB

為了進一步研究巨噬細胞在SCI微環境中的作用及其對血管內皮細胞的潛在影響，我們提取并鑒定了來自M1-BMDMs (M1-Exos)的外泌體。脊髓損傷后立即注射外泌體，在指定時間進行一系列行為評估(圖4A)。BMS行為分析表明，M1-Exos注射可導致脊髓損傷后后肢運動功能評分降低(圖4B)。足跡分析、電生理測試和游泳測試顯示了類似的結果，M1-Exos處理導致更短的步幅(圖4C)，更低的MEPs振幅(圖4D)，更傾斜的身體角度，更下垂的尾巴(圖4E)。EB外滲實驗顯示，M1-Exos處理組有更多EB染料滲漏到間隙中(圖4F)， TEM下血管TJs的電子密度遠低于PBS組，兩內皮細胞之間的間隙也更明顯(圖4G)。此外，注射M1-Exos后，脊髓病變中血管ZO-1的熒光強度顯著減弱(圖4H)；TJs蛋白表達水平也明顯下調(圖4I)。我們還發現，M1-Exos給藥后，病變區域更多的α-SMA與CD31共存(圖4J)；I型膠原、III型膠原和α-SMA蛋白水平上調，CD31表達降低(圖4K)。以上結果表明，M1- Exos可能誘發EndoMT加重脊髓損傷后BSCB的損傷，阻礙運動功能恢復。

5）M1-Exos通過傳遞miR-155加重了EndoMT

為了研究外泌體miR-155在SCI后M1-Exos介導的BSCB破壞惡化中的作用，構建miR-155過表達(miR-155^OE)和敲低(miR-155^KD) BMDMs，然后分離外泌體并處理bEnd.3細胞。如圖5A和B所示，miR-155^OE-Exos組TEER值顯著降低，通透性顯著增加，而miR-155^KD-Exos組則相反。加入miR-155^OE-Exos后，ZO-1和Occludin的熒光強度明顯降低，而miR-155^KD-Exos處理后，ZO-1和Occludin的表達顯著增強(圖5C和D)。此外，western blot檢測TJs蛋白的表達，結果與上述討論的結果相似(圖5E)。miR-155^OE-Exos可促進細胞形態轉化，其分支更少，體細胞更長。miR-155^KD-Exos處理后的結果則相反(圖5F)。miR-155^OE-Exos暴露后，I型膠原蛋白、III型膠原蛋白和α-SMA蛋白水平上調，CD31蛋白水平下調，而miR-155^KD-Exos作用相反(圖5G)。以上結果表明，外泌體miR-155在促進bEnd.3細胞的EndoMT中起著至關重要的作用。

6）M1-Exos通過傳遞miR-155上調ROS水平，損害bEnd.3細胞線粒體功能

我們研究了外泌體miR-155與bEnd.3細胞中線粒體功能的關系。我們發現，與miR-NC^OE-Exos相比，miR-155^OE-Exos處理上調了ROS水平(圖6A和B)，線粒體超氧化物水平(圖6C和D)和線粒體電位(圖6E)；然而，miR-155^KD-Exos處理則顯示了相反的結果(圖6A-E)。此外，miR-155^OE-Exos可使線粒體腫脹更大，形態更短，線粒體碎片細胞比例更高，而miR-155^KD-Exos可減輕線粒體腫脹(圖6F和G)。miR-155^OE-Exos處理后的OCR、基礎呼吸、ATP產生、呼吸能力和呼吸逆轉均明顯下降，而miR-155^KD-Exos處理減輕了氧化呼吸功能障礙(圖6H和I)。這些結果表明，上調外泌體miR-155可導致過度ROS的產生和線粒體功能障礙。

7）miR-155負調控SOCS6表達，激活NF-κB通路

為了進一步探討外泌體miR-155誘導EndoMT和線粒體功能障礙的潛在機制，我們重點研究了miR-155的下游基因。首先，利用在線miRNA靶標數據庫預測了84個潛在靶基因。SOCS6是具有3’UTR的下游mRNA之一，可能與miR-155結合(圖7A)。結合GSE49329和GSE49330數據庫，我們發現miR-155的表達與SOCS6的表達呈負相關(圖7B)。為了進一步證實SOCS6 3’UTR是miR-155的直接靶標，我們根據預測的結合位點(圖7C)構建了SOCS6 3’UTR野生型(WT)和突變型(MUT)序列。熒光素酶報告實驗顯示，與對照組相比，共轉染SOCS6的WT-3’UTR時，miR-155過表達明顯降低了熒光素酶活性(圖7D)。qRT-PCR和western blot進一步顯示，miR-155過表達導致SOCS6表達降低，而miR-155敲低上調SOCS6 mRNA和蛋白水平(圖7E和F)。GO分析顯示miR-155可以負向調控細胞-細胞粘附，參與調控成纖維細胞增殖(圖7G)。從GO分析可知，miR-155可能介導NF-κB信號通路(圖7G)。過表達miR-155可顯著提高細胞質和細胞核中p65蛋白的水平，而敲低miR-155可起到相反的作用(圖7H)。

8）SOCS6通過泛素化和降解p65抑制NF-κB信號通路

鑒于miR-155通過增強細胞質和細胞核中p65的表達負調控SOCS6的表達，并激活NF-κB信號通路，我們下一步研究SOCS6與p65之間潛在的相互作用。首先，我們在bEnd.3細胞中過表達或下調SOCS6。發現p65表達與SOCS6水平呈負相關(圖8A)。Discovery Studio?分析的3D對接也表明SOCS6可能與p65相互作用(圖8B)。此外，熒光共定位實驗表明，SOCS6與p65在細胞質中共定位(圖8C和D)， Co-IP實驗進一步揭示了SOCS6與p65的相互作用(圖8E)。值得注意的是蛋白酶體MG132可以部分逆轉SOCS6過表達對p65蛋白水平的抑制作用(圖8F)。同時，在環己酰亞胺的情況下，SOCS6的沉默顯著延緩了內源性p65的降解速率，而過表達SOCS6則顯著加速了p65的降解(圖8G)。最后，通過泛素化實驗驗證SOCS6是否通過蛋白酶體降解誘導p65失穩。我們發現過表達SOCS6增加了bEnd.3細胞中p65多聚泛素化。沉默SOCS6則相反(圖8H)。綜上所述，這些結果表明SOCS6可以與p65結合并誘導其多聚泛素化和蛋白酶體降解。

9）M1-Exos通過miR-155/ SOCS6/p65軸加重了bEnd.3細胞的EndoMT

為了探討外泌體miR-155/SOCS6/p65軸在M1-Exos誘導的EndoMT中的作用，我們在體外進行了一系列功能喪失和功能獲得實驗。我們發現，SOCS6過表達部分逆轉了miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos誘導的TEER值降低和通透性增加(圖9A和B)。ZO-1和Occludin的熒光強度進一步顯示SOCS6過表達顯著逆轉了miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos在bEnd.3細胞中引起的TJs破壞(圖9C)。此外，EndoMT標記物的蛋白水平與這些結果一致，SOCS6上調可消除miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos介導的p65上調(圖9D)。值得注意的是，當miR-NC^KD-Exos或miR-155^KD-Exos下調SOCS6時，則出現相反的結果(圖9E-H)。

 10）M1-Exos在bEnd.3細胞中通過miR-155/SOCS6/p65軸上調ROS水平，損害線粒體功能

我們進行了一系列功能喪失和功能獲得實驗來研究miR-155/SOCS6/p65軸在調節線粒體功能中的作用。如圖10A -E所示，SOCS6過表達消除了miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos誘導的ROS水平(圖10A和B)、線粒體超氧化物含量(圖10C和D)和線粒體電位(圖10E)的升高。此外，SOCS6過表達顯著緩解了miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos處理后的線粒體腫脹，并降低了線粒體碎片細胞的比例(圖10F和G)。進一步的結果表明，SOCS6過表達可挽救miR-NC^OE-Exos或miR-155^OE-Exos處理導致的OCR、基礎呼吸、ATP產生、呼吸能力和呼吸逆轉的下降(圖10H和I)。miR- NC^KD-Exos或miR-155^KD-Exos處理后沉默SOCS6則出現相反的結果(圖10J-R)。

結論：在本研究中，我們發現SCI后浸潤的巨噬細胞可通過傳遞外泌體miR-155促進EndoMT，損害線粒體功能，從而加重BSCB完整性，隨后通過抑制SOCS6誘導的p65降解，激活NF-κB通路。我們的工作可能會加強對巨噬細胞和血管內皮細胞之間相互干擾的理解，并揭示脊髓損傷后BSCB完整性的潛在調節機制。