腫瘤異質(zhì)性包括形態(tài)異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性一直是腫瘤研究的熱點，因為它對準確診斷和個體化治療都提出了一系列挑戰(zhàn)。胃腺癌（GA）是一種異質(zhì)性惡性疾病的典型代表，具有不同的亞型和臨床表現(xiàn)。

單細胞RNA測序（scRNA-seq）和微流控技術(shù)的進展為科研工作者提供了同時描述數(shù)千個細胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的方法。該方法允許對生物組織內(nèi)的細胞特征進行分析，并已廣泛應用于包括癌癥免疫異質(zhì)性在內(nèi)的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)分析。另一方面，放大內(nèi)鏡下的靶向活檢仍然是最準確的GA診斷方法，因為它允許臨床醫(yī)生觀察病變并捕獲富含腫瘤細胞的組織。結(jié)合內(nèi)鏡活檢的單細胞轉(zhuǎn)錄組實驗將有助于更準確的遺傳病病理診斷。

今天我們來講一篇關(guān)于單細胞RNA測序分析原發(fā)性胃腺癌的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的文獻，文章題名為：Dissecting transcriptional heterogeneity in primary gastric adenocarcinoma by single cell RNA sequencing，發(fā)表于GUT雜志，影響因子19.819。該文章主要對9個GA腫瘤樣本和3個非腫瘤樣本的27677個細胞進行了無偏轉(zhuǎn)錄組的scRNA-seq分析。

不同GA類型的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

為了研究各種病變胃粘膜內(nèi)的細胞群和相關(guān)分子特征，樣本選取5個腸道組織學GA樣本，3個混合組織學GA樣本，1個彌漫組織學GA樣本和3個對照樣本。去除低質(zhì)量細胞后，保留27677個細胞用于生物學分析，每個細胞檢測到1227個基因和3809個轉(zhuǎn)錄物。在基因表達標準化和主成分分析（PCA）之后，使用基于圖的聚類將細胞劃分為14個聚類。這些簇可通過標記基因分配給9個已知的細胞譜系：上皮細胞（10411細胞，37.6%，用EPCAM、KRT18和KRT8標記）、壁細胞（215細胞，0.8%，用ATP4A標記）、內(nèi)分泌細胞（486細胞，1.8%，用CHGA標記）；B細胞（6131細胞，22.1%，用MS4A1和CD79A標記）；T細胞（6819細胞，24.6%，用CD2、CD3D和CD3E標記）；巨噬細胞（1053細胞，3.8%，用CD14標記）；肥大細胞（527細胞，1.9%，用CPA3標記）；成纖維細胞（1116細胞，4.0%，用ACTA2和COL1A2標記）；內(nèi)皮細胞（919細胞，3.3%，用ENG和VWF標記）。每個細胞譜系的比例在不同的樣本中差異很大（圖1F）。

惡性與非惡性上皮的分類

為了區(qū)分惡性和非惡性上皮，利用k-means聚類算法，根據(jù)初始評分定義惡性上皮細胞和非惡性上皮細胞。由于TCGA大塊組織的初始識別由于包含非上皮細胞而存在偏差，接下來在假定的惡性和非惡性上皮細胞之間產(chǎn)生差異表達基因，重新計算惡性/非惡性評分并分類上皮細胞。重復這個過程，直到分類結(jié)果穩(wěn)定為止。最后，鑒定了5635個惡性上皮細胞和4776個非惡性上皮細胞。一組腫瘤特異性基因（CLDN4、CLDN7、TFF3和REG4），在惡性上皮上調(diào)。非惡性上皮表現(xiàn)出與胃粘液和消化酶分泌相關(guān)的標記基因的高表達，如MUC5AC、GKN1、PGC和LIPF。為了研究惡性和非惡性上皮的分子特征差異，又進行了基因集富集分析（GSEA）。與非惡性上皮相比，惡性上皮富含TNF-α/NF-κB、KRAS和IL-6/JAK/信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子。還有其他對癌癥發(fā)展和進展至關(guān)重要的富集基因集，如MYC靶點、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成。

轉(zhuǎn)錄組分析揭示了主細胞、頸細胞和SPEM之間的關(guān)系

慢性炎癥引起的癌前胃化生一直是胃癌發(fā)生研究的熱點。一些研究已經(jīng)報道，主要細胞可能異常分化為頸部細胞，然后由于壁細胞的丟失而導致粘液細胞化生，稱為SPEM。根據(jù)數(shù)據(jù)，在癌組織和CG粘膜組織樣本中很少檢測到表達ATP4A和ATP4B的壁細胞。還對非惡性細胞進行亞聚類，發(fā)現(xiàn)了四個不同的組。G1組細胞占細胞總數(shù)的78.0%，通過TFF2、GKN1和MUC5AC基因的表達可區(qū)分為表面細胞。G2組的細胞表現(xiàn)出高水平的標記基因，如PGA3、PGA4和LIPF，并被定義為主要細胞。還發(fā)現(xiàn)G3細胞表達標志物PGA3和MUC6，可定義為增生性/肥大性粘液頸部細胞，免疫染色也驗證了表達。

G4簇主要由癌變粘膜細胞組成。這些細胞的特征是頸部細胞標記物MUC6、化生轉(zhuǎn)錄物TFF2、CD44和SOX9以及主要組織相容性復合體II類（MHC-II）基因的高表達水平。免疫染色還顯示，主細胞、頸細胞和SPEM共存于同一組織中，并且從胃腺基部到腺頸逐漸按主細胞、頸細胞和SPEM的順序排列，支持主細胞到頸細胞到SPEM的過渡推斷。接下來進一步研究細胞類型之間的潛在轉(zhuǎn)換。從Monocle得到的時間軌跡軸表明，主細胞可以轉(zhuǎn)分化為粘膜頸細胞，然后再分化為SPEM。特定代表性基因的時間表達動力學也標志著主要細胞向粘膜頸部細胞的進展，然后進入SPEM。本文的結(jié)果首次在單細胞水平上描繪了主細胞的潛在分化途徑，并表明它們可能產(chǎn)生化生細胞。

GA惡性細胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性

對5635個惡性細胞進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)了5個顯著的細胞亞群（C1-C5）。惡性細胞主要根據(jù)Lauren的組織病理學類型和背景因素（EBV感染）進行分組。觀察到，9名患者的C1-C5比例不同。C1幾乎全部（96.9%）來自彌漫型樣本（DGC），而C2主要來自腸型樣本（IGC）（97.1%）。C3含有混合型（MGC）和腸型樣本細胞的混合物。C4主要來源于一個腸型GC樣本（IGC3），C5包括來自EBV+患者（IGC5）的細胞。通過比較基因表達譜，我們發(fā)現(xiàn)C1/C2/C3與Lauren分類的三個典型亞型一致，C4/C5是兩個新的細胞亞型，與C1/C2/3相比具有明顯的分子特征。

經(jīng)典Lauren組織病理類型GA的分子特征

接下來我們研究了C1、C2和C3的分子特征（圖5A）。C1高表達一些在胃上皮細胞中廣泛表達的基因（如CLDN18和TFF2）（圖5B），但在C2中很少檢測到這些基因。相反，C2表現(xiàn)出與小腸相似的重要分子特征，這是由腸細胞標記物（如APOA1和FABP2）的廣泛表達所支持的（圖5C）。這些結(jié)果也通過KRT20和CLDN18免疫染色進行了驗證（在線補充圖S7）。C3沒有顯示出明顯的分子特征，但部分表達了C1和C2的兩個標記，表明它是C1和C2的中間亞群，而不是C1和C2的混合物。此外，我們觀察到三個亞組之間的分化分數(shù)不同（圖5D）。PHGR1、KRT20和MDK的表達水平在C2中最高，在C3中中等，但在C1中最低（圖5E）。這些結(jié)果表明，C1代表一個未分化狀態(tài)的亞群，C2代表一個不同的具有成熟腸細胞特征的分化良好的惡性細胞亞群，C3代表C1和C2之間的中間狀態(tài)。我們的結(jié)果描繪了單細胞分辨率下不同勞倫組織類型的獨特分子特征。

GA-FG-CCP的轉(zhuǎn)錄組分析

C4的惡性細胞主要來自腸型GA樣品IGC3。H&E染色結(jié)果顯示腫瘤位于胃底腺，主要由分化的顆粒細胞組成。scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示C4廣泛表達主要細胞標記物（如LIPF、PGC和PGA3），并且表現(xiàn)出中等水平的分化評分。我們鑒定了一些在C4中特異表達的基因，其中一些被報道調(diào)控Wnt/β-catenin通路，即RNF43 35。GO富集分析證實C4中的特征基因富集用于調(diào)節(jié)生長和Wnt/β-catenin通路。免疫熒光染色顯示，這些細胞主要分布在胃腺體基底部，MUC6和胃蛋白酶原-I（PGA3）強烈共表達。C4亞組細胞的組織病理學表現(xiàn)和表型表達模式與GA-FG-CCP的細胞特征高度一致。

總的來說，該研究為破譯胃腫瘤異質(zhì)性提供了寶貴的資源，這將為精確診斷和預后提供幫助。