研究背景：

逆轉免疫抑制腫瘤微環境(TME)是提高腫瘤免疫治療敏感性的一項戰略舉措。最新研究表明，環二鳥苷酸(c-di-GMP或cdG)可誘導干擾素基因刺激因子(STING)途徑激活抗原呈遞細胞(APCs)，增強腫瘤免疫原性。但是，研究顯示cdG在血漿中清除快，膜通透性差，細胞內生物利用度不足。因此，Yi-Ping Chen在ACS Appl Mater Interfaces(IF=8.758)這一雜志發表文章，探索一種基于納米藥物的全面的原位接種方法，以觸發抗腫瘤免疫。

技術路線圖：

研究結果：

1.    RMSN-PEG-TA的制備與表征

采用經典的軟模板法合成帶有熒光RITC的單分散二氧化硅納米微球(MSNs) ，并進一步用PEG和TA進行了修飾，所獲得的納米顆粒命名為RMSN-PEG-TA， TEM圖像顯示其平均直徑為26.7±4.8 nm(Figures 1a).。MSN直徑非常小，能夠很容易的通過腫瘤基質。MSN聚乙二醇化，用DLS確定平均大小，顯示在完全培養基中較好的分散性。平均直徑為46.6 ±0.3 nm(Figure 1b)。RMSN-PEG-TA的等電點(IEP)為8.87，在pH 7.4條件下表面電位約為+28 mV，適合細胞攝取和載藥實驗（Figure1c）。如Figure 1d所示，RMSN-PEG-TA的氮氣吸附脫附等溫線為IV型，總Brunauer Emmett Teller (BET)表面積為36m²/g。用BJH法計算得到的平均孔徑為2.3 nm。

Figure 1

2. 在體外，cdG@RMSN-PEG-TA納米顆粒處理激活免疫細胞因子的產生。

用不同劑量的RMSN-PEG-TA培養RAW 264.7細胞6小時，觀察熒光密度（Figure 2a）。在37℃條件下，4.42% PEG- cdG體外釋放譜指定時間為300/PBS。我們觀察到85%的cdG在8小時內釋放（Figure 2b）。為了證實cdG通過STING依賴的信號通路觸發免疫反應。cdG@RMSN-PEG-TA處理后，參與STING激活的IL-1β, IFN-β和IL-6水平顯著升高。RMSN-PEG-TA和free cdG不觸發細胞因子的表達。cdG通過調節STING-TBK1-IRF3通路影響一型干擾素的產生，刺激固有免疫應答。WB結果顯示cdG和cdG@

RMSN-PEG-TA處理組中STING磷酸化水平顯著增加。結果顯示RMSN-PEG-TA能夠引起STING的激活，導致免疫因子的產生。

Figure 2

3.體內，cdG@RMSN-PEGTA的抗腫瘤作用增強

研究顯示，CDNs（循環二核苷酸）可通過STING依賴信號通路刺激固有免疫和適應性免疫，導致腫瘤退化。接下來文章評估cdG@RMSNPEG-TA在接種4T1乳腺癌BALB/c小鼠中的抗腫瘤作用。cdG能夠部分抑制腫瘤生長，cdG@RMSN-PEG-TA顯示顯著的抗腫瘤作用，這種作用可能是由于細胞吸收更好和cdG的原位持續釋放(Figure 3b)。體重沒有減輕說明在實驗中沒有表現出毒性作用(Figure 3c)。cdG@RMSN-PEG-TA處理組腫瘤最小(Figure 3d)，cdG@RMSNPEG-TA組平均腫瘤重量比對照組低近4倍，比游離cdG組低2.18倍。

為了直接評估腫瘤的增殖情況，我們進一步通過免疫組化方法分析了腫瘤切片中核蛋白Ki-67的表達情況。Ki-67在cdG@RMSNPEG-TA治療后表達最低(圖4a)，這與腫瘤抑制研究結果一致。染色發現cdG@RMSN-PEG-TA可以誘導更高水平的STING 磷酸化(p-Ser365)，這表明通過STING依賴的信號通路可以抑制腫瘤生長(圖4b)。

Figure 3

Figure 4

4. cdG@RMSN-PEG-TA納米顆粒注射觸發TME內免疫反應。

據報道，TME中STING通路的激活可促進淋巴細胞浸潤，從而介導癌癥免疫治療。接下來，我們研究了攜帶4t1的Balb/c小鼠TME內抗腫瘤免疫的激活。如圖3a所示，在第15天收集腫瘤，進行免疫熒光和流式細胞術分析。cdG@RMSN-PEG-TA處理24小時后，仍有3%的分離細胞檢測出RITC陽性，表明cdG@RMSN-PEG-TA確實被在體內吞噬(圖5a)。如圖5b所示，我們發現空的陽離子RMSN-PEG-TA僅略微增強腫瘤中CD 45+白細胞、Ly6C+單核細胞和CD 4+ T細胞總數，而對CD11c+樹突狀細胞、F4/80+巨噬細胞和CD 8+ T細胞無影響。考慮到RMSN-PEG-TA單獨不能抑制腫瘤生長，且體重沒有變化(圖3b，c)，我們假設RMSN-PEG-TA免疫原性較弱。游離cdG處理組，腫瘤中F4/80+巨噬細胞、cd4 + T細胞、cd8 + T細胞明顯增多。腫瘤浸潤淋巴細胞的增強提示STING激動劑可以激活TME內的APCs，進而進一步激活下游的適應性免疫反應，導致細胞毒性T細胞的招募。與可溶性cdG相比，cdG@RMSN-PEG-TA制劑能顯著促進STING激動劑刺激的腫瘤浸潤白血病細胞，包括CD11c+樹突狀細胞、F4/ 80+巨噬細胞、CD 4+ T細胞和CD 8+ T細胞。cdg@rmsn - peg - tatated組腫瘤中cd8 + T細胞的百分比是cdG處理組的7.9倍。結果表明cdG@RMSN-PEG-TA治療刺激了腫瘤中的淋巴細胞浸潤，導致了較低的免疫抑制TME，這與我們的腫瘤回歸研究一致。

由于樹突狀細胞通常被認為是STING依賴免疫反應的關鍵角色，隨后分析了cdG@RMSN-PEGTA在腫瘤微環境中的定位，重點分析了CD11c+樹突狀細胞的群體。流式細胞儀結果顯示，CD11c+樹突狀細胞非常有效地吸收了給予的納米顆粒，特別是在cdG@RMSN-PEG-TA納米顆粒治療后(圖5c)。免疫組化染色分別在腫瘤組織切片上證實細胞核定位，DAPI染色(藍色)和抗cd11c抗體染色(綠色)的樹突狀細胞定位(圖5d)。在merge并后的圖像中觀察到CD11c+細胞與cdG@RMSN-PEG-TA (紅色)的共定位，這與圖5c的流式細胞術結果一致。

Figure 5