肺癌是最普遍的癌癥，也是與癌癥相關的死亡的主要原因，每年在全球造成200萬以上的新診斷和170萬死亡。大約85%的肺癌診斷為非小細胞肺癌（NSCLC），其中50％以上的腺癌和30%的鱗狀癌。由于非典型癥狀，約三分之二的NSCLC患者在診斷時出現晚期疾病。已鑒定出NSCLC腫瘤中的許多體細胞突變，致癌性重排或拷貝數變異，包括EGFR基因19號外顯子的缺失，L858R或T790M突變，MET基因14號外顯子的跳躍突變，ALK或ROS1重排，MET，EGFR或HER2的拷貝數增加。各種小分子抑制劑和單克隆抗體已經被開發靶向這些基因改變和顯著改善NSCLC患者的預后。盡管取得了這些進展，但目前尚無針對KRAS突變的NSCLC患者的具體治療策略，KRAS突變是10-20%的NSCLC患者中最常見的致癌驅動因素。此外，已在KRAS突變的NSCLC中鑒定出常見的共突變伴侶，包括TP53，LKB1和CDKN2A。這些共突變因子提供了不同的基因表達譜，并可能確定針對KRAS突變的NSCLC的不同治療策略。近期，武漢大學鐘波教授，林丹丹教授及華中科技大學褚倩教授發現CCL7通過募集常規DC1（cDC1）促進Kras^LSL-G12D/+Tp53^fl/fl（KP）和Kras^LSL-G12D/+Lkb1^fl/fl（KL）NSCLC小鼠模型的抗PD-1治療，促進T細胞擴增，相關研究以“CCL7 recruits cDC1 to promote antitumor immunity and facilitate checkpoint immunotherapy to non-small cell lung cancer”為題發表在Nature communications上，雜志影響因子12.121。

技術路線：

結果：

1、  CCL7在NSCLC腫瘤組織中高表達

作者從楔形切除或肺葉切除的18名NSCLC患者中收集了腫瘤和正常肺組織，并通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析了CCL7的表達，發現腫瘤組織中CCL7的mRNA水平明顯高于正常組織（圖a）。隨后，作者從NSCLC患者中收集了另一組共44對的腫瘤和正常肺組織，發現CCL7在腫瘤組織中高表達（圖b），且免疫組織化學和集成光密度分析的結果證實腫瘤組織中CCL7的蛋白水平高于正常肺組織（圖c）。此外，高CCL7蛋白水平與NSCLC患者的總生存（OS）有顯著正相關（圖d）。以上數據表明，CCL7在NSCLC腫瘤組織中上調，并與NSCLC患者的OS正相關。接下來，作者在獲得的KP（Kras^LSL-G12D/+小鼠和Tp53^fl/fl小鼠雜交）/KP7小鼠（Ccl7^-/-小鼠與KP小鼠雜交）中鼻內注射Ad-Cre病毒，十周后進行流式細胞儀分析發現CCL7^IRES?ZsGreen在CD11c⁺CD11b^?H-2K^b?CD103^?肺泡巨噬細胞（AM）中表達，但在CD11c⁺CD11b^?H-2K^b+CD103⁺樹突細胞（DCs）、CD11b⁺CD11c^?細胞、CD19⁺ B細胞、CD4⁺或CD8⁺ T細胞中不表達（圖e-g），且CCL7^IRES?ZsGreen在CD45.2^?CD31⁺CD81^?CD49d^?內皮細胞、CD45.2^?CD31^?CD81⁺CD49d^?成纖維細胞以及CD45.2^?CD31^?CD81^?CD49d^?腫瘤細胞中被發現，而在CD45.2^?CD31⁺CD49d⁺基質細胞中沒有表達。這些數據說明腫瘤誘導后KP小鼠肺部多種細胞中的CCL7被上調。

2、  CCL7缺失促進KP小鼠模型的腫瘤發生

作者通過鼻內注射Ad-Cre病毒誘導KP/KP7小鼠肺腫瘤發生，KP7小鼠的中位OS為82天，而KP小鼠的中位OS則明顯更長（105天）（圖a，b）。組織學分析表明誘導腫瘤后6-10周，KP小鼠或KP7小鼠肺部的腫瘤數量相當（圖c，d）。此外，誘導后第6周的KP小鼠和KP7小鼠的腫瘤大小和面積相當，而誘導后第8或10周的KP7小鼠肺部的腫瘤大小和面積明顯更大（圖 2e，f），表明CCL7缺失在早期不影響NSCLC腫瘤的發生，但是在晚期抑制腫瘤的進展。這些數據說明在KP小鼠模型中CCL7在NSCLC發育中的抑制作用。

3、  CCL7缺失會削弱cDC1向荷瘤肺的浸潤

作者制備了來自誘導后10周的KP小鼠和KP7小鼠的腫瘤負擔的肺的單細胞懸液，并用各種單核細胞標記物染色，然后進行流式細胞術分析，發現KP7小鼠肺的總細胞數多于KP小鼠，可能是由于KP7小鼠的腫瘤大小大于KP小鼠（圖a，b），且KP7小鼠肺中CD11c⁺CD11b^-細胞的百分比和細胞數量比KP小鼠顯著減少（c）。作者進一步發現，與KP小鼠相比，KP7小鼠荷瘤肺中表達高水平的CD86、XCR1和CD24以及低水平的CD64的CD11c⁺CD11b^?CD103⁺H2K^b+ DCs數量顯著減少（圖d，e）。這些數據表明CCL7主要吸引KP小鼠模型中荷瘤肺中的cDC1。在此背景下，作者發現與CD11c⁺CD11b^?CD103^?H-2K^b?肺泡巨噬細胞或CD11c^?CD11b⁺ 細胞相比，CCL7受體CCR1、CCR2和CCR3在cDC1上高表達（圖d）。然而有趣的是，KP小鼠或KP7小鼠肺中CD11c⁺CD11b^?細胞上CD103，H-2K^b的百分比相當，來自KP小鼠或KP7小鼠肺的cDC1表達相當的CD86、XCR1、CD24或CCL7受體，表明CCL7缺失不影響cDC1的活化或分化或活化cDC1上CCL7受體的表達，而在腫瘤誘導后10周，與KP小鼠相比，KP7小鼠肺腫瘤中cDC1的數量顯著減少，CD11c、CD103和XCR1的強度顯著降低(圖d-f)。這些數據表明CCL7是cDC1最佳浸潤到荷瘤肺所必需的，但不是浸潤cDC1活化所必需的。

4、  CCL7缺失會削弱抗腫瘤免疫反應的激活

作者分析了支氣管引流淋巴結（dLNs）中的適應性免疫反應，發現來自KP7小鼠的支氣管dLNs的總細胞數明顯少于來自KP小鼠的支氣管dLNs（圖a）, 盡管在腫瘤誘導后10周，KP小鼠和KP7小鼠支氣管dLN中CD8⁺ T細胞的百分比相當， 而與KP小鼠對比，CD8⁺IFNγ⁺ T細胞的數量顯著減少，表明在KP小鼠模型中腫瘤誘導后CCL7缺失損害支氣管dLN中CD8⁺ T細胞擴增(圖b)。接著，作者通過Percoll介導的梯度離心從KP小鼠和KP7小鼠的荷瘤肺中分離出肺浸潤淋巴細胞（LIL），利用各種淋巴細胞標記物進行染色，流式分析發現與誘導腫瘤后10周的KP小鼠肺相比，KP7小鼠肺中LILs的總細胞數明顯減少（圖c）。與KP小鼠相比，KP7小鼠LILs中CD8⁺ 或CD8⁺IFNγ⁺ T細胞數量顯著降低（圖d，e）。總的來說，這些數據表明CCL7缺失損害了KP小鼠模型支氣管dLN和荷瘤肺中T細胞的擴增和聚集。

5、  CD11c⁺ DC的消耗可促進KP小鼠模型中NSCLC的發育

作者將CD11c^-白喉毒素受體（DTR）骨髓細胞轉移到經輻照的KP小鼠或KP7小鼠體內，然后進行腫瘤誘導和DT介導的CD11c⁺細胞耗竭（圖a）。通過DT處理，有效的消除了KP小鼠或KP7小鼠肺中的CD11c⁺或CD11c⁺CD103⁺H-2K^b+ DC（圖b）。在KP小鼠和KP7小鼠中，CD11c⁺ DCs的耗竭顯著促進NSCLC的發展， DT處理的KP小鼠和KP7小鼠的荷瘤肺和生長相當（圖c，d）, 表明在KP小鼠模型中CCL7介導的CD11c⁺ DCs募集在抑制腫瘤發生中的重要作用。與此一致，DT處理后，KP小鼠或KP7小鼠支氣管dLN和LILs中的CD8⁺IFNγ⁺ T細胞以及腫瘤中CD8、XCR1和CD11c染色的強度顯著降低（圖e-g）。

6、  在KP小鼠模型中，肺中給予CCL7可抑制NSCLC

作者對KP小鼠和KP7小鼠鼻內注射Ad-Cre病毒，6周后分別向這些小鼠鼻內注射Lenti-Vec或Lenti-CCL7，免疫組化分析證實了在注射Lenti-CCL7的KP小鼠或KP7小鼠的肺中CCL7的表達，與相應的對照組相比，注射CCL7可以顯著延長KP小鼠或KP7小鼠的生存期并抑制其腫瘤發展（圖a-e）。同時發現，與注射對照病毒的小鼠相比，注射了CCL7的KP小鼠或KP7小鼠的腫瘤肺中浸潤性cDC1的數量以及CD11c，XCR1和CD8染色的強度顯著增加（圖f，g）。這些數據表明CCL7在KP小鼠模型中充當NSCLC的治療劑。

7、  CCL7增強抗PD-1檢查點免疫療法的功效

作者在有或沒有腹膜內注射抗PD-1的情況下，每周兩次向KP小鼠鼻內注射Ad-Cre，然后進行Lenti-Vec或Lenti-CCL7注射，持續4周，發現抗PD-1治療顯著延長了KP小鼠的存活，與注射空載體相比，通過注射CCL7進一步延長了存活，且抗PD-1治療顯著抑制了KP小鼠的腫瘤發展，與空載體相比，聯合注射CCL7進一步抑制了其發展（圖a-c）。此外，與單獨使用抗PD-1治療相比，CCL7和抗PD-1的聯合治療顯著增加了KP小鼠肺中CD11c⁺或XCR1⁺ DC和CD8⁺ T細胞的浸潤(圖d-e)。

接著，作者檢查了CCL7是否可以在KL小鼠模型中促進抗腫瘤免疫，通過KL小鼠經鼻內注射Ad-Cre，5周后感染Lenti-Vec或Lenti-CCL7，然后進行分析或存活觀察，發現CCL7顯著延長了KL小鼠的存活，并抑制了KL小鼠中的NSCLC發育，且增加了KL小鼠腫瘤中CD11c，XCR1和CD8的染色（圖a-c）。同時發現抗PD-1治療沒有明顯改善KL小鼠的存活，而與單獨使用抗PD-1治療相比，CCL7和抗PD-1的組合顯著延長了KL小鼠的存活(圖d)。作者回顧了接受帕博利珠單抗或信迪利單抗治療的晚期NSCLC患者CT引導下穿刺活檢中CCL7的水平和抗PD-1免疫治療的療效，結果表明，部分緩解或疾病穩定患者活檢組織中CCL7和CD11c+和CD8+細胞的染色顯著高于疾病進展患者（圖f，e），表明CCL7可作為NSCLC檢查點免疫治療的預后或診斷標志物。

結論：

1.      CCL7在NSCLC腫瘤組織中表現出高表達，并且與腫瘤微環境（TME）中cDC1的浸潤和NSCLC患者的整體生存呈正相關。

2.      CCL7缺失損害了cDC1在TME中的浸潤以及隨后CD8 ⁺和CD4 ⁺ T細胞在支氣管引流淋巴結和TME中的擴增，從而促進了KP小鼠模型中的腫瘤發展。

3.      CCL7單獨或與抗PD-1聯合肺內給藥可顯著抑制KP小鼠和KL小鼠的腫瘤發展并延長其生存期。

參考文獻：

Man Zhang, Wei Yang, Peng Wang, et al. CCL7 recruits cDC1 to promote antitumor immunity and facilitate checkpoint immunotherapy to non-small cell lung cancer. Nature communication. 2020.