導(dǎo)語：曲妥珠單抗耐藥已成為乳腺癌治療的主要障礙，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在耐藥性的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而，其潛在機(jī)制尚不清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(lncRNAs)參與腫瘤進(jìn)展，參與調(diào)節(jié)曲妥珠單抗耐藥性。MSCs與lncRNAs產(chǎn)生哪些調(diào)控效應(yīng)，這里告訴你。

參考文獻(xiàn)：IF=7.971

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1. MSC引起乳腺癌（BC）細(xì)胞干性和曲妥珠單抗耐藥
為分析MSCs對(duì)干性和曲妥珠單抗耐藥的影響，將SKBR-3和BT474兩種HER-2 + BC細(xì)胞系與MSCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的球形形成能力顯著提高，干性基因均顯著上調(diào)，CD4陽性細(xì)胞的比例增加。CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)降低了曲妥珠單抗介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)曲妥珠單抗耐藥。

在異種移植模型中證實(shí)MSC的作用。將SKBR-3細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，或與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合注射，各組腹腔內(nèi)給予曲妥珠單抗治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SKBR-3細(xì)胞單獨(dú)作用未能生成異種移植物，然而，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞混合物成功建立了異種移植物，增加了SKBR-3細(xì)胞移植的腫瘤重量。IHC檢測(cè)曲妥珠單抗耐藥組織和BC患者曲妥珠單抗應(yīng)答組織中MSC表面抗原CD29和CD90的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)耐藥組CD29 +/CD90 + 患者的比例顯著增高，較高的CD29 +/CD90 + 組織與臨床分期呈正相關(guān)。以上結(jié)果提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)干性和曲妥珠單抗耐藥。

2. MSC誘導(dǎo)的lncRNA AGAP2-AS1介導(dǎo)干性和曲妥珠單抗耐藥

為鑒定AGAP2-AS1是否由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)，檢測(cè)其在與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的SKBR-3和BT474細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與MSCs共培養(yǎng)的細(xì)胞中AGAP2-AS1顯著上調(diào)。AGAP2-AS1在CD29 + CD90 + 患者BC組織中上調(diào)。研究AGAP2-AS1對(duì)干性的影響，過表達(dá)AGAP2-AS1后BC細(xì)胞中AGAP2-AS1和干性基因上調(diào)，CD44 + BC細(xì)胞比例增加，誘導(dǎo)BC細(xì)胞球體形成和曲妥珠單抗耐藥。沉默AGAP2-AS1效果相反。這些表明MSC通過誘導(dǎo)AGAP2-AS1引起干性和曲妥珠單抗耐藥。

3. AGAP2-AS1對(duì)干性和曲妥珠單抗耐藥性的作用依賴于FAO

使用starBase3.0獲得AGAP2-AS1的靶基因，并通過DAVID6.8進(jìn)行KEGG通路分析。發(fā)現(xiàn)AGAP2-AS1靶基因在代謝中顯著富集，如FAO代謝。MSC共培養(yǎng)誘導(dǎo)了CPT1的活性和β-氧化率的增強(qiáng)，這種效應(yīng)被敲除AGAP2-AS1所抵消。AGAP2-AS1的沉默也可逆轉(zhuǎn)MSC引起的CPT1、乙酰輔酶A合成酶(ACS)和ATP水平的上調(diào)。為證實(shí)FAO對(duì)于MSC-AGAP2-AS1誘導(dǎo)的干性和曲妥珠單抗耐藥性至關(guān)重要，使用FAO抑制劑依托莫西韋，發(fā)現(xiàn)抑制FAO可逆轉(zhuǎn)AGAP2-as1誘導(dǎo)的干性基因，可消除AGAP2-AS1誘導(dǎo)的曲妥珠單抗耐藥。表明MSC通過AGAP2-as1介導(dǎo)FAO誘導(dǎo)干性和曲妥珠單抗耐藥。

4. AGAP2-AS1與HuR相互作用

進(jìn)一步探索AGAP2AS1的調(diào)控機(jī)制，利用RNA FISH和細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)分離qPCR鑒定亞細(xì)胞位置。結(jié)果提示，AGAP2-AS1位于細(xì)胞質(zhì)。使用生物素化的AGAP2-AS1進(jìn)行了RNA pull down實(shí)驗(yàn)，質(zhì)譜分析和western blotting鑒定出AGAP2-AS1的RNA結(jié)合蛋白-ELAV家族成員HuR。RIP試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)AGAP2-AS1和HuR之間的直接相互作用RNA-FISH驗(yàn)證AGAP2-AS1和HuR共定位在SKBR-3細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，系列缺失分析發(fā)現(xiàn)AGAP2-AS1的900-1531nt區(qū)域?qū)εcHuR結(jié)合至關(guān)重要。POSTAR2預(yù)測(cè)在AGAP2-AS1的937-957nt區(qū)域顯示HuR的結(jié)合基序。而且，敲除HuR可消除干性和曲妥珠單抗耐藥性。上述結(jié)果證實(shí)AGAP2-AS1可能通過與HuR蛋白相互作用，在干性和曲妥珠單抗耐藥中發(fā)揮重要作用。

5. AGAP2-AS1-HuR復(fù)合物促進(jìn)CPT1的穩(wěn)定性
由于CPT1在AGAP2-AS1調(diào)節(jié)的FAO過程中上調(diào)，假設(shè)CPT1可能是AGAP2-AS1–HuR復(fù)合物的直接靶點(diǎn)。MSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)CPT1的上調(diào)，當(dāng)AGAP2-AS1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中沉默時(shí)，這種上調(diào)被廢除，證明MSC來源的AGAP2-AS1誘導(dǎo)CPT1上調(diào)。敲低HuR可顯著抑制CPT1表達(dá)，并在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均可消除AGAP2-AS1誘導(dǎo)的CPT1表達(dá)。通過CPT1 RNA探針進(jìn)行RNA pull down，驗(yàn)證HuR和CPT1之間的直接相互作用，HuR抗體進(jìn)行RIP分析進(jìn)一步驗(yàn)證。

使用放線菌素D阻斷RNA轉(zhuǎn)錄時(shí)， HuR沉默細(xì)胞中CPT1 RNA的穩(wěn)定性被顯著抑制。過表達(dá)AGAP2-AS1增加CPT1 mRNA的穩(wěn)定性，HuR沉默顯著逆轉(zhuǎn)此類效應(yīng)，表明HuR對(duì)于AGAP2-AS1誘導(dǎo)的CPT1 mRNA穩(wěn)定性至關(guān)重要。以上結(jié)果表明AGAP2-AS1–HuR直接結(jié)合CPT1 mRNA并維持其穩(wěn)定性。

6. AGAP2-AS1海綿miR-15a-5p釋放CPT1
HuR部分逆轉(zhuǎn)AGAP2-AS1誘導(dǎo)的效應(yīng)，假設(shè)AGAP2-AS1可能存在其他調(diào)節(jié)途徑，如作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA。在線預(yù)測(cè)軟件鑒定AGAP2-AS1靶向的miRNA，qPCR驗(yàn)證4個(gè)miRNA在AGAP2-AS1過表達(dá)BC細(xì)胞中下調(diào)，發(fā)現(xiàn)CPT1被預(yù)測(cè)為評(píng)分較高的miR-15a-5p的靶點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，miR-15a-5p可顯著抑制AGAP2-AS1和CPT1的熒光素酶活性，pull down試驗(yàn)證實(shí)了AGAP2-AS2與miR-15a-5p、miR-15a-5p和CPT1之間的直接相互作用。miR-15a-5p模擬物顯著抑制干性，增加曲妥珠單抗介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，逆轉(zhuǎn)AGAP2-AS1引起的CPT1水平升高。共表達(dá)miR15a-5p可消除AGAP2-AS1誘導(dǎo)的干性蛋白和曲妥珠單抗耐藥性。以上結(jié)果證明AGAP2-AS1/miR-15a-5p/CPT1調(diào)節(jié)軸在干性和曲妥珠單抗耐藥中的重要作用。

7. AGAP2-AS1促進(jìn)體內(nèi)干性和曲妥珠單抗耐藥性
為證實(shí)AGAP2-AS1在干性和曲妥珠單抗耐藥性中的重要作用，在BALB/c裸鼠中建立了異種移植瘤模型。將轉(zhuǎn)染pcDNA-AGAP2-AS1的SKBR-3細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合后接種于小鼠皮下，小鼠接受曲妥珠單抗治療。發(fā)現(xiàn)曲妥珠單抗治療顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，然而，當(dāng)細(xì)胞與AGAP2-AS1過表達(dá)時(shí)，這種效應(yīng)被急劇逆轉(zhuǎn)，過表達(dá)AGAP2-AS1的SKBR-3細(xì)胞生成的腫瘤表現(xiàn)出較高的AGAP2AS1和較低的miR-15a-5p表達(dá)。曲妥珠單抗在異種移植物中減少的CPT1的表達(dá)可通過AGAP2-AS1過表達(dá)來挽救。IHC分析顯示，在過表達(dá)AGAP2-AS1的異種移植物中，CPT1染色較高，而AGAP2-AS1未改變HuR染色。表明AGAP2-AS通過靶向體內(nèi)CPT1介導(dǎo)干性和曲妥珠單抗耐藥性。

8. AGAP2-AS1預(yù)測(cè)BC患者對(duì)曲妥珠單抗的治療反應(yīng)

分析接受曲妥珠單抗治療的患者血清樣本，發(fā)現(xiàn)無應(yīng)答患者中AGAP2-AS1上調(diào)。受試者工作特征(ROC)曲線顯示AGAP2-AS1在區(qū)分有反應(yīng)和無反應(yīng)患者方面具有相對(duì)較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，ROC曲線將患者分為AGAP2-AS1高表達(dá)或低表達(dá)組，AGAP2-AS1高表達(dá)組對(duì)曲妥珠單抗治療表現(xiàn)出反應(yīng)的患者百分比遠(yuǎn)低于AGAP2AS1低表達(dá)組。