鐵死亡是一種與脂質(zhì)過氧化相關(guān)的調(diào)節(jié)壞死的鐵依賴形式。盡管它在鐵死亡的炎癥結(jié)果中起關(guān)鍵作用，但在這種類型的細(xì)胞死亡過程中導(dǎo)致質(zhì)膜破壞的分子事件知之甚少。

2020年11月，來自德國(guó)科隆大學(xué)遺傳學(xué)研究所、埃伯哈德-卡爾大學(xué)生物化學(xué)學(xué)院間研究所、德拉薩大學(xué)化學(xué)系等團(tuán)隊(duì)合作在Cell Death & Differentiation雜志上發(fā)表了文章“Ferroptotic pores induce Ca2+ fluxes and ESCRT-III activation to modulate cell death kinetics.”。此文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)Ca2+的持續(xù)增加是鐵死亡的一個(gè)標(biāo)志，它發(fā)生在細(xì)胞完全破裂之前。質(zhì)膜損傷導(dǎo)致鐵死亡與半徑只有幾納米的膜納米孔有關(guān)，而鐵死亡可以被滲透保護(hù)劑延遲，而不是脂質(zhì)過氧化。鐵死亡過程中的Ca2+通量可誘導(dǎo)ESCRT-III 依賴的膜修復(fù)機(jī)制的激活，從而平衡細(xì)胞死亡動(dòng)力學(xué)并調(diào)節(jié)鐵死亡的免疫學(xué)特征。團(tuán)隊(duì)關(guān)于鐵死亡的發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)統(tǒng)一的概念，即在質(zhì)膜破裂之前胞漿Ca2+的持續(xù)增加是受調(diào)控的壞死類型的共同特征，并將ESCRT-III激活作為這些溶性細(xì)胞死亡途徑中的一般保護(hù)機(jī)制。

鐵死亡是一種不依賴于caspase的調(diào)控性壞死，其特征是細(xì)胞膜中產(chǎn)生鐵依賴的脂質(zhì)過氧化物。通過鐵死亡導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的特征是質(zhì)膜破裂和釋放其他受限的細(xì)胞內(nèi)成分，包括促炎癥損傷相關(guān)的分子模式。因此，鐵死亡這種類型的細(xì)胞死亡與壞死性炎癥和先天免疫系統(tǒng)的激活有關(guān)。已有研究表明，鐵死亡可導(dǎo)致缺血/再灌注損傷、組織損傷和器官死亡，以及其他幾種病理，包括神經(jīng)退行性疾病和癌癥。因此，了解鐵死亡過程中膜破裂的分子機(jī)制不僅具有生物學(xué)意義，而且具有醫(yī)學(xué)意義。

執(zhí)行鐵死亡的一個(gè)基本步驟是質(zhì)膜的最終破壞。然而，然而，導(dǎo)致質(zhì)膜完整性喪失的分子機(jī)制以及鐵死亡癥膜損傷的性質(zhì)和大小仍未被探索。其他形式的壞死細(xì)胞死亡，如壞死性死亡、或毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡對(duì)質(zhì)膜的損傷導(dǎo)致離子通量的激活。在這些情況下，Ca2+通量與膜修復(fù)機(jī)制的激活有關(guān)。轉(zhuǎn)運(yùn)所需的核內(nèi)體分選復(fù)合體(ESCRT)機(jī)制似乎發(fā)揮了關(guān)鍵的平衡作用，可以延遲壞死和焦亡中的細(xì)胞死亡。

在不同的細(xì)胞模型中，研究了Erastin-1和RSL3觸發(fā)鐵死亡時(shí)質(zhì)膜通透性的分子機(jī)制。利用活細(xì)胞成像和流式細(xì)胞術(shù)，我們并行追蹤了鐵死亡不同特征的動(dòng)力學(xué)。我們發(fā)現(xiàn)在鐵死亡過程中脂質(zhì)過氧化發(fā)生在胞質(zhì)Ca2+持續(xù)增加和最終質(zhì)膜破裂之前。我們還確定納米孔的形成是鐵死亡過程中觸發(fā)質(zhì)膜破裂的核心機(jī)制，因此，適當(dāng)大小的滲透保護(hù)劑可以抑制質(zhì)膜破裂。最后，將鐵死亡中胞質(zhì)Ca2+的增加與ESCRT-III機(jī)制的激活聯(lián)系起來，該機(jī)制作為一種延遲細(xì)胞死亡的保護(hù)機(jī)制。這對(duì)免疫有影響，因?yàn)?/span>ESCRT-III的缺失可調(diào)節(jié)鐵死亡細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，從而重塑鐵死亡的炎癥特征。研究結(jié)果支持ESCRT-III機(jī)制在調(diào)節(jié)壞死過程中平衡膜損傷和調(diào)節(jié)免疫結(jié)果的一般作用。

技術(shù)路線：

一、胞漿內(nèi)Ca2+的持續(xù)增加是鐵死亡的一個(gè)標(biāo)志

在使用Erastin-1或RSL3處理的小鼠成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)中，我們通過活細(xì)胞共聚焦成像(圖1A, B)和流式細(xì)胞術(shù)(圖1C H)檢測(cè)細(xì)胞漿Ca2+水平，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)和質(zhì)膜破裂的變化。我們使用氟-4乙酰氧基甲基(氟-4 AM)作為Ca2+指示劑[27]的熒光形式，來觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，PI作為不可逆質(zhì)膜破壞和細(xì)胞死亡的標(biāo)記。

在使用Erastin-1或RSL3處理NIH-3T3細(xì)胞后，胞漿Ca2+濃度明顯升高(圖1A, B)。這伴隨著細(xì)胞形狀的改變，包括細(xì)胞圓形和出現(xiàn)單個(gè)腫脹水泡，隨后質(zhì)膜完整性完全破裂。當(dāng)用RSL3處理人類纖維肉瘤細(xì)胞(HT-1080)和人類乳腺癌細(xì)胞(Mda-157)時(shí)，也可以看到類似的事件(圖S1)。在所有的細(xì)胞模型系統(tǒng)中，最終的膜破壞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+和fluo - 4am染料的損失，盡管動(dòng)力學(xué)和擴(kuò)展取決于所使用的鐵下垂誘導(dǎo)物和所研究的細(xì)胞系(圖1和S1)。胞漿Ca2+、細(xì)胞圓化和質(zhì)膜破裂的增加均被鐵死亡抑制劑鐵他汀-1 (Fer- 1)特異性抑制，但壞死抑制劑壞死性他汀-1 (necc -1s)和泛半胱天酶抑制劑zVAD均未被抑制，表明所有這些事件都是鐵死亡的特征(圖1A F)。

與NIH-3T3細(xì)胞類似，fer1也完全抑制了RSL3處理后HT-1080和Mda-157細(xì)胞胞漿Ca2+的增加和細(xì)胞死亡(圖S1)。

我們通過流式細(xì)胞術(shù)平行追蹤fluo - 4am和PI熒光的時(shí)間過程(圖1G, H)。獨(dú)立于治療，胞漿Ca2+在質(zhì)膜破裂前數(shù)小時(shí)就出現(xiàn)了增加。

在erastin -1處理的細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)fer1并沒有完全消除胞漿內(nèi)Ca2+的增加(圖1A)，約40%的細(xì)胞群保留fluo - 4am陽性(圖1C, G)。

相反，當(dāng)RSL3誘導(dǎo)鐵死亡時(shí)，fer1完全阻止胞質(zhì)Ca2+的增加(圖1B, D, H)。這些結(jié)果表明，Erastin誘導(dǎo)了兩種不同的Ca2+信號(hào)通路:一個(gè)與鐵死亡無關(guān)，另一個(gè)與鐵死亡特異。

胞質(zhì)Ca2+的晚期增加可以被認(rèn)為是鐵死亡的標(biāo)志，因?yàn)樗?/span>fer1抑制，在Erastin-1或RSL3-誘導(dǎo)的鐵死亡中很常見。 

二、脂質(zhì)氧化先于胞質(zhì)Ca2+的增加和質(zhì)膜的破裂

使用活細(xì)胞共聚焦顯微鏡在單細(xì)胞水平上量化了fluo - 4am信號(hào)的增加、細(xì)胞圓度和PI攝入。從單細(xì)胞動(dòng)力學(xué)曲線(圖2C, F, K)來看，計(jì)算了實(shí)現(xiàn)每種鐵死亡表型50%變化(t50)所需的時(shí)間。

這使得我們可以設(shè)置鐵死亡過程中每個(gè)過程之間的延遲時(shí)間(圖2D, G, L)。

與使用的鐵晶體觸發(fā)器無關(guān)，胞質(zhì)Ca2+的增加先于細(xì)胞圓化和完全的質(zhì)膜塌陷(圖2A, B)。

然而，流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)表明(圖1G)，在存在Erastin-1的情況下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加是一個(gè)兩階段的過程，具有兩相行為(圖2C)。

第一個(gè)事件在最大Ca2+信號(hào)的40%左右達(dá)到飽和，對(duì)應(yīng)于不相關(guān)的鈣(Ca2+ un)增加，因?yàn)樗鼪]有被fer1抑制(圖1)。

第二種Ca2+升高，這是RSL3處理的常見現(xiàn)象，并被fer1抑制(圖1H和2F)，對(duì)應(yīng)于胞漿內(nèi)Ca2+升高，特異性于鐵下垂(Ca2+ sp)。

在時(shí)間上，Ca2+ un在Erastin-1處理后增加，隨后是Ca2+ sp上升，細(xì)胞圓角和最終的PI攝入量(圖2C E)。

相比之下，rsl3處理的細(xì)胞具有獨(dú)特的特異性Ca2+升高事件，隨后是細(xì)胞圓整和最終的PI攝入(圖2F-H)。

為了觀察膜中的脂質(zhì)過氧化，我們使用了脂質(zhì)過氧化傳感器C11 BODIPY 581/591。RSL3處理確實(shí)促進(jìn)了質(zhì)膜和亞細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，可以通過增加BODIPY (BODIPYox)的綠色熒光信號(hào)來檢測(cè)(圖2I)。接下來，我們平行追蹤氧化率和細(xì)胞圓角的變化(圖2J, K)。脂質(zhì)過氧化先于細(xì)胞圓角。考慮到胞漿Ca2+的增加到細(xì)胞圓角的滯后時(shí)間始終低于脂質(zhì)過氧化到細(xì)胞圓角的滯后時(shí)間，我們可以估計(jì)，Ca2+的增加發(fā)生在脂質(zhì)過氧化之后(圖2M)。

這一估計(jì)是基于fluo - 4am增加的獨(dú)立動(dòng)力學(xué)(圖2fh)和BODIPY氧化率(圖2K, L)之間的外推。

三、滲透活性藥物保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡

孔的形成是不同類型調(diào)控細(xì)胞死亡的共同特征，包括凋亡[29]、壞死[13]和焦亡[30]。質(zhì)膜孔的打開導(dǎo)致水分子的凈流入，這是由于高濃度的不能通過膜孔的細(xì)胞內(nèi)大分子造成的滲透不平衡的結(jié)果(圖3A)。可以通過添加適當(dāng)大小的不能通過孔進(jìn)入細(xì)胞的滲透保護(hù)劑來阻止這種影響，從而平衡細(xì)胞內(nèi)滲透壓、水流入和隨之而來的細(xì)胞崩潰(圖3B)。由此可見，聚乙二醇(peg)的滲透作用可以調(diào)節(jié)膜孔的滲透性，而離子通道的滲透性則不受調(diào)節(jié)。為了研究在鐵死亡細(xì)胞中觀察到的質(zhì)膜通透性是否與膜孔有關(guān)，我們?cè)u(píng)估了不同大小的peg對(duì)不同鐵死亡的動(dòng)力學(xué)和程度的影響。

更小的peg的添加達(dá)到4000，并沒有阻止胞漿Ca2+的增加，細(xì)胞圓角或細(xì)胞死亡(圖3C F和S2)。

相比之下，高分子量peg(6000和8000)存在時(shí)，細(xì)胞漿Ca2+水平的升高和細(xì)胞死亡都以大小依賴的方式延遲(圖3D, F和S2D)。

在PEG 8000的存在下，我們還觀察到細(xì)胞舍圓動(dòng)力學(xué)的延遲(圖3E)。這些結(jié)果表明，胞漿Ca2+的增加、細(xì)胞圓潤(rùn)和質(zhì)膜破裂都是由滲透力驅(qū)動(dòng)的事件。值得注意的是，PEG 8000對(duì)鐵死亡的保護(hù)作用在洗滌后恢復(fù)，這表明隨著時(shí)間的推移，膜損傷是穩(wěn)定的(圖3G)。我們還發(fā)現(xiàn)，PEG 8000不能防止rsl3處理的NIH-3T3細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化(圖3H, I)。

值得注意的是，對(duì)于所有使用的PEG大小，當(dāng)NIH-3T3細(xì)胞處理較長(zhǎng)時(shí)間(24小時(shí))時(shí)，細(xì)胞死亡恢復(fù)(圖3J)。

peg對(duì)鐵死亡動(dòng)力學(xué)的抑制作用也隨著RSL3濃度的增加而降低(圖3K、L和S3A)。

以在低濃度RSL3下能夠起到保護(hù)作用的PEG大小作為參考，我們可以粗略估計(jì)在2.5 nm半徑附近的質(zhì)膜穿孔部分較小的尺寸(圖3L)。

四、ESCRT-III復(fù)合物在鐵死亡過程中被激活并拮抗細(xì)胞死亡

最初，CHMP4B主要表現(xiàn)為均勻的胞漿分布，然而，在RSL3處理后，蛋白定位于不同的斑點(diǎn)，隨著時(shí)間的推移，蛋白數(shù)量和熒光強(qiáng)度增加(圖4A、B和S4)。

這一觀察結(jié)果與報(bào)道的CHMP4B在壞死[22,23]和焦亡[17]中的行為相似，表明ESCRT-III復(fù)合體在鐵死亡過程中被激活。

接下來，我們通過活細(xì)胞共聚焦成像在單細(xì)胞水平上量化了CHMP4B斑點(diǎn)形成與細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度增加、細(xì)胞圓角和最終質(zhì)膜破裂的時(shí)間相關(guān)性。CHMP4B斑點(diǎn)的形成大致與胞質(zhì)Ca2+濃度的增加相吻合(圖4C E和S4)。

此外，這些結(jié)果表明，細(xì)胞聚集在這兩個(gè)事件發(fā)生的同一時(shí)間(圖4C E)，這與滲透力的假定作用是一致的。在細(xì)胞漿Ca2+水平持續(xù)升高、細(xì)胞圓化和esrt - iii復(fù)合體激活后發(fā)生最終的膜破裂，可能是當(dāng)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制最終被淹沒時(shí)(圖4B, E, F)。

PEG 8000也阻斷了CHMP4B斑點(diǎn)的形成，這可能是抑制Ca2+通量的結(jié)果(圖4G J)。

為了檢驗(yàn)ESCRT-III在鐵死亡中的功能作用，我們?cè)u(píng)估了敲除CHMP4B對(duì)NIH-3T3細(xì)胞死亡的影響(圖5A, B)。

我們開始使用蛋白質(zhì)組分析器XL細(xì)胞因子陣列試劑盒(圖5C和S6)來確定鐵下垂是否可以直接調(diào)節(jié)不同細(xì)胞系中的細(xì)胞因子分泌。

在鐵下垂的誘導(dǎo)下，我們檢測(cè)到出現(xiàn)細(xì)胞系和治療依賴的細(xì)胞因子亞群水平的變化。此外，敲除CHMP4B改變了RSL3(圖5C, D)或Erastin-1(圖S6C)處理后獲得的細(xì)胞因子譜。