2020年12月，來(lái)自中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國(guó)科學(xué)院大學(xué)與北京理工大學(xué)生物工程學(xué)院團(tuán)隊(duì)合作在Science advance雜志上發(fā)表了文章“Targeted exosome coating gene-chem nanocomplex as "nanoscavenger" for clearing α-synuclein and immune activation of Parkinson's disease.”。此文獻(xiàn)描述了一個(gè)工程核-殼雜交系統(tǒng)，名為狂犬病毒糖蛋白(RVG)肽修飾的外泌體(EXO) curcumin/苯基硼酸-聚(2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯)納米粒子/靶向SNCA (REXO-C/ANP/S)的小干擾RNA。它是一種清除-突觸核蛋白聚集物并降低其在帕金森病神經(jīng)元中的細(xì)胞毒性的納米清除劑。經(jīng)REXO-C/ANP/ s治療后，帕金森病小鼠的運(yùn)動(dòng)行為得到顯著改善。團(tuán)隊(duì)也證明REXO-C/ANP/S是一種清除免疫激活的納米清除劑，因?yàn)槠涮烊徊怀墒斓臉?shù)突狀細(xì)胞外膜。總之，REXO-C/ANP/S可作為神經(jīng)退行性疾病的治療平臺(tái)。

對(duì)于神經(jīng)退行性疾病，可以利用基因和小分子藥物協(xié)同清除引起神經(jīng)元變性的病理物質(zhì)。

在帕金森病(Parkinson s disease, PD)中，α突觸核蛋白 (α-syn)聚集物被認(rèn)為是主要的病理物質(zhì)。siRNA在罕見(jiàn)疾病或沒(méi)有良好藥物選擇的疾病中表現(xiàn)出潛力，但與基因相關(guān)。例如，針對(duì)SNCA的siRNA (siSNCA)可以通過(guò)下調(diào)α-syn蛋白的合成來(lái)抑制α-syn聚集物的形成。神經(jīng)保護(hù)小分子藥物姜黃素對(duì)已有的α-syn聚集物具有降低作用。因此，siSNCA與姜黃素聯(lián)合可以協(xié)同降低α-syn聚集物對(duì)PD治療多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞毒性。然而，因?yàn)樗鼈兊奈漳芰Σ睿玛惔x快，這些生物利用度較差的藥物難以在靶神經(jīng)元的作用部位聚集。此外,腦輸送問(wèn)題主要表現(xiàn)為輸送系統(tǒng)難以通過(guò)血腦屏障(BBB)，不能準(zhǔn)確識(shí)別靶細(xì)胞。

合成基因和化學(xué)藥物(gene-chem)納米復(fù)合物，包括脂質(zhì)體和聚合物顆粒，已被修飾為細(xì)胞穿透多肽或細(xì)胞靶向分子，以增強(qiáng)藥物輸送在腦疾病或其他疾病的治療。然而，合成的納米復(fù)合物容易被識(shí)別為外來(lái)物，導(dǎo)致自然免疫激活、細(xì)胞凋亡、血液循環(huán)時(shí)間短，不安全且效率低。此外，當(dāng)這些合成載體被內(nèi)化時(shí)，會(huì)經(jīng)歷一個(gè)內(nèi)溶酶體途徑，這往往導(dǎo)致藥物降解和胞外作用，并導(dǎo)致炎性小體激活。此外，有必要控制藥物在病變區(qū)域的釋放，以減少非特異性毒性。因此，為了有效地將基因化學(xué)藥物遞送到靶細(xì)胞的作用部位以實(shí)現(xiàn)PD的安全治療，有必要開(kāi)發(fā)一種能夠克服這些遞送瓶頸的遞送系統(tǒng)，包括低血腦屏障通透性、神經(jīng)元靶向性差、胞漿內(nèi)吞效率低下和藥物釋放不可控等。

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，作者設(shè)計(jì)了一種靶向外泌體涂層基因-化學(xué)納米復(fù)合物，作為神經(jīng)元α-syn聚集物和PD免疫激活的工程納米清除劑。外泌體是一種經(jīng)過(guò)充分研究的siRNA和化學(xué)藥物的天然源載體，直徑為30至100納米。它具有一種膜結(jié)構(gòu)，其表面特異性蛋白四asppanin CD9促進(jìn)直接膜融合，并幫助內(nèi)部物質(zhì)直接運(yùn)輸?shù)绞荏w細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，避免了溶酶體誘捕。

進(jìn)一步有效地提供藥物通過(guò)BBB和多巴胺能神經(jīng)元,第一個(gè)過(guò)程的工程是構(gòu)建殼,REXO一種靶向的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(imDC)衍生的外泌體，該外泌體由狂犬病毒糖蛋白(RVG)肽修飾而成，具有29個(gè)氨基酸，能特異性結(jié)合神經(jīng)元細(xì)胞和BBB表達(dá)的乙酰膽堿受體。由于外泌體很難同時(shí)裝載親水基因和疏水小分子藥物，工程的第二個(gè)過(guò)程是作為一個(gè)基因-化學(xué)包覆核心的產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)的，這是一個(gè)響應(yīng)活性氧(ROS)的基因化學(xué)藥物納米復(fù)合物裝載這兩種不同特性的藥物。第三種工藝是REXO-C/ANP/S納米清除劑的制備。REXO被涂在納米復(fù)合物上形成納米清除劑。因此，該工程傳遞系統(tǒng)能夠有效穿過(guò)血腦屏障，靶向神經(jīng)元，并在多巴胺能神經(jīng)元病變的高ROS環(huán)境中釋放藥物。富集的siSNCA和姜黃素對(duì)α-syn蛋白下調(diào)和α-syn聚集抑制具有協(xié)同作用。

技術(shù)路線(xiàn)：

一、REXO-C/ANP/S的制備方法及表征

雜化納米粒子(NP) REXO-C/ANP/S的制備由兩部分組成(圖1A):基因化學(xué)核心C/ANP/S的制備和REXO的獲取。核心C/ANP/S是通過(guò)兩步法得到的。首先，我們合成了聚合物ba -聚(2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯)(BAP)和bb -聚(2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯)(BBP)(圖S1A)。

核磁共振H表明BAP和BBP合成成功(圖S1, B到D)。兩親性聚合物BAP可自組裝并包封疏水性藥物姜黃素，形成姜黃素/BAP NP (C/ANP)。采用Multiskan光譜法計(jì)算姜黃素在NP中的加載率，加載率為70%。接下來(lái)，通過(guò)靜電相互作用形成最終的C/ANP/siSNCA (C/ANP/S)和C/BNP/siSNCA (C/BNP/S)納米配合物(圖1A)。隨后運(yùn)用gel retardation assay，現(xiàn)siSNCA完全附著在5的N/P(聚合物的氮部分/ siRNA的磷部分)C/ANP(圖S2A)。

第二部分是rvg修飾外泌體的制備REXO，使用頻率為40 kHz、功率為100 W的bath超聲器，通過(guò)超聲波方法組裝內(nèi)芯和外部REXO(圖1A)。。

分離并收集含有外泌體的指定編號(hào)7,8,9的片段。通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)確定imDC外泌體為囊泡結(jié)構(gòu)，水動(dòng)力直徑約為70 nm, zeta電位為12.7 mV(圖2E)。

DiD外泌體與硬脂酰rvgfitc的共定位系數(shù)為0.95(圖S3E)，表明RVG成功修飾外泌體。

組裝過(guò)程假設(shè)如圖1B所示，并通過(guò)TEM、尺寸和zeta電位測(cè)量進(jìn)行驗(yàn)證(圖1C)。

在REXO和C/ANP/S復(fù)合物中，在REXO-to-C/ANP/S質(zhì)量比0.05以下，REXO吸附到C/ANP/S部分表面(圖1C, I)。

當(dāng)NPs的質(zhì)量比為0.01時(shí)，NPs的粒徑增加到141.0 nm, zeta電位下降到7.05 mV。當(dāng)比值為0.05時(shí)，存在一個(gè)中間態(tài)。尺寸增大到437.5 nm, TEM顯示C/ANP/S通過(guò)REXO交聯(lián)(圖1C, II)。最后，負(fù)電荷占主導(dǎo)地位的NPs趨于穩(wěn)定。

當(dāng)質(zhì)量比為0.1時(shí)，最終的核-殼單分散組裝形成如圖1C (III)所示，這表明REXO被涂覆在核納米配合物的表面。最終的NP REXO-C/ANP/S帶負(fù)電荷7.1 mV，流體動(dòng)力直徑為118.1 nm(圖1D)。

接下來(lái)，為了便于直觀(guān)觀(guān)察組裝組分，制備了帶正電的聚殼聚糖微球，允許帶負(fù)電的組裝體在表面吸附(圖1E)。

外泌體用親脂性染料DiI標(biāo)記。結(jié)果清楚地顯示了DiI外泌體、Cy5-siRNA和姜黃素的共定位(圖1E和圖S3F)。

此外，組裝后得到的REXO-C/ANP/S含有EXO的TSG101和CD9蛋白(圖1F)，進(jìn)一步表明包衣成功。 

二、通過(guò)REXO涂層增強(qiáng)REXO- c /ANP/S的藥物傳遞

模擬REXO-C/ANP/S和C/ANP/S的體外給藥過(guò)程。我們使用Transwell培養(yǎng)法模擬血腦屏障(圖2A, I)。

bEnd.3細(xì)胞在Transwell插入物中培養(yǎng)7天(6孔中插入1x105個(gè)細(xì)胞，孔徑0.4 m, 4.67 cm2)，形成單層細(xì)胞，經(jīng)上皮電阻至少200歐姆·cm2。

加入NPs后，利用柯達(dá)體內(nèi)成像系統(tǒng)FX Pro進(jìn)行生物發(fā)光成像，檢測(cè)Cy5平均熒光強(qiáng)度。REXO涂層顯著增強(qiáng)了C/ANP/S中siRNA藥物進(jìn)入bEnd.3細(xì)胞。然后通過(guò)上皮細(xì)胞分化為SH-SY5Y細(xì)胞(圖2A, II至IV)。作為比較,增加免費(fèi)RVG肽抑制促進(jìn)效應(yīng)(圖2,II IV)。通過(guò)比較的siRNA SH-SY5Y細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(圖2 b),發(fā)現(xiàn)REXO涂層顯著提高藥物的吸收在C / ANP / S。2小時(shí)后，EXO和REXO包衣組EXO-C/ANP/S和REXO-C/ANP/S顯著優(yōu)于裸姜黃素和siRNA(裸C + S)以及內(nèi)核C/ANP/S。這是因?yàn)?/span>C/ANP/S中的季胺類(lèi)化合物通過(guò)核內(nèi)體-溶酶體途徑將C/ANP/S內(nèi)吞，造成NP外排和藥物損失，因此藥物積累隨著時(shí)間的增加并不明顯(圖2B)。

共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較了兩種體系的內(nèi)吞機(jī)制(圖2C)。

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DiI的熒光增強(qiáng)，從5分鐘到1小時(shí)，明顯與深紅色膜染色的熒光共定位(圖2D和圖S4B)。  

三、REXO-C/ANP/S增強(qiáng)了α-syn清除

α-syn聚集物是PD神經(jīng)元的主要病理物質(zhì)。因此，清除PD處理中的α-syn聚集物和多余的-syn非常重要(圖3A)。

裸藥和不同NPs與SNCA mCherry SH-SY5Y細(xì)胞共培養(yǎng)2天。 CLSM觀(guān)察到-α-syn mCherry過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中的α-syn聚集物，其中mCherry為α-syn的紅色報(bào)告因子(圖3B)。

Western blot也驗(yàn)證了總α-syn表達(dá)[圖。3、C和D;47 kDa (α-syn為18 kDa, mCherry為29 kDa)]。

與無(wú)姜黃素的NP REXO-ANP/S和siNonsense NP REXO-C/ANP/siNonsense相比，REXO-C/ANP/S具有下調(diào)優(yōu)勢(shì)。

此外，除REXO-C/ANP/ siNonsense處理的細(xì)胞外，np處理的細(xì)胞SNCA mRNA表達(dá)低于pbs處理的細(xì)胞。REXO-C/ANP/S處理后的細(xì)胞SNCA mRNA表達(dá)下降64%(圖3E)。此外，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)顯示，NP用藥組處理的細(xì)胞中-syn聚集物顯著減少(圖3F)。 

四、增強(qiáng)體內(nèi)神經(jīng)元恢復(fù)

給藥10次后記錄行為。PD小鼠在開(kāi)闊區(qū)域表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)遲緩，并且在中間區(qū)域行走較少(圖4A, II)。

在開(kāi)闊場(chǎng)地進(jìn)行30分鐘的定量數(shù)據(jù)顯示，它們的總距離減小，移動(dòng)速度減慢，所需的休息時(shí)間變長(zhǎng)[圖2]。4、B to D (II)。

NP組小鼠的運(yùn)動(dòng)能力有改善的趨勢(shì)，尤其是REXO-C/ANP/S組[圖4]。4、B到D (III到VI)]。

在極點(diǎn)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)REXO-C/ANP/S處理后，到達(dá)桿尖的時(shí)間明顯縮短(圖4E)。

這種優(yōu)勢(shì)在小鼠解剖后的大腦切片中也得到了體現(xiàn)。注射REXO-C/ANP/S的PD小鼠神經(jīng)元修復(fù)效果優(yōu)于其他各組(圖4,F和G)。

此外，蘇木精對(duì)np處理過(guò)的小鼠臟器載玻片染色表明其安全性，不會(huì)對(duì)小鼠肝臟或其他臟器造成負(fù)擔(dān)(圖S7)。

五、α-syn的納米掃描和異常免疫激活

通過(guò)對(duì)處理小鼠SN區(qū)進(jìn)行染色，我們得出協(xié)同載藥C/ANP/S納米復(fù)合物對(duì)TH+神經(jīng)元α-syn有清除作用，但EXO-C/ANP/S和REXO-C/ANP/S的清除作用更明顯，特別是靶向NP REXO-C/ANP/S(圖5,a和C)。這是由于靶向外泌體優(yōu)越的遞送優(yōu)勢(shì)。此外，我們還探索了小鼠免疫微環(huán)境的改善。結(jié)果表明，imDC外泌體的作用可以清除PD小鼠的T細(xì)胞激活。在小鼠經(jīng)NPs處理后，我們發(fā)現(xiàn)EXO-C/ANP/S，特別是REXO-C/ANP/S可以顯著增加CD4陽(yáng)性(CD4+) T細(xì)胞中Fox p3的表達(dá)(圖5,B和D)。

此外，REXO-C/ANP/S可顯著增加PD中TGF-和IL-10(圖5,E, F)。已有研究證實(shí)TGF-信號(hào)具有抗炎作用，主要是神經(jīng)保護(hù)作用。此外，IL-22和IL-17與自身免疫性疾病相關(guān)，并以免疫細(xì)胞因子的形式高表達(dá)。激活的TH17細(xì)胞分泌并產(chǎn)生IL-22和IL-17免疫細(xì)胞因子。結(jié)果表明，REXO-C/ANP/S可顯著降低PD中IL-22和IL-17因子(圖5,G和H)。