Dana-Farber癌癥研究所Praveen Anand課題組發(fā)現(xiàn)，通過對惡性和微環(huán)境細胞的全長單細胞RNA測序，研究了攜帶活化NOTCH1突變的復發(fā)/難治性早期t細胞祖細胞急性淋巴細胞白血病的耐藥機制。我們發(fā)現(xiàn)了兩種高度不同的干細胞樣狀態(tài)，它們在細胞周期和致癌信號傳導方面存在顯著差異。快速循環(huán)的干細胞樣白血病細胞表現(xiàn)出Notch激活，通過Notch抑制可有效消除患者體內(nèi)的Notch，而緩慢循環(huán)的干細胞樣細胞不依賴于Notch信號通路，而是依賴于PI3K信號通路。該研究還發(fā)現(xiàn)這兩種干細胞樣狀態(tài)都可以分化為更成熟的白血病狀態(tài)，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，包括LGALS9檢查點分子的高表達。這些細胞通過表達LGALS9的同源受體HAVCR2，功能失調(diào)的CD8+ T細胞克隆積累促進免疫抑制白血病生態(tài)系統(tǒng)。研究確定了信號程序、細胞可塑性和免疫程序之間復雜的相互作用，這些程序是T-ALL的特征，并說明了腫瘤異質(zhì)性的多維性。相關論文于2020年11月23日發(fā)表在《Blood》雜志上。

急性T淋巴細胞白血?。═-ALL）是一種侵襲性的惡性血液腫瘤，主要發(fā)生了兒童和青年人。雖然T-ALL患者的總體預后較好，但仍有20%左右的患者對常規(guī)治療無應答，大部分這類患者都屬于復發(fā)性或難治性疾病。多種破壞正常胸腺細胞發(fā)育的細胞遺傳學和分子遺傳都可導致T-ALL，大部分病例可根據(jù)胸腺細胞不同的成熟狀態(tài)劃分亞組。

早期急性T前體淋巴細胞白血?。‥TP-ALL）是一種特殊的T-ALL亞型，顯示出獨特的遺傳和轉(zhuǎn)錄特征，表明它們與髓系前體細胞和髓系惡性腫瘤有密切的關系。目前還不清楚這些特征是否同時存在于單個ETP-ALL細胞中，是否能夠反映腫瘤細胞群中離散的、異質(zhì)的細胞狀態(tài)。 

樣本信息：

收集NCT01363817試驗（應用了Notch抑制劑BMS-906024）招募的攜帶NOTCH1激活突變的復發(fā)性/難治性ETP-ALL患者的血液或骨髓樣本。建立了T-ALL的移植瘤動物模型（PDX），采用了多種腫瘤細胞系：DND-41、KOPT-K1、HPB-ALL、Loucy、MOLT-4、NALM-6、SEM、KG-1、Jurkat 和HL-60。

技術路線： 

一、難治性ETP-ALL細胞表達與正常淋巴細胞和造血祖細胞相關的轉(zhuǎn)錄因子

A-D通過進行PAGODA2聚類和t隨機鄰居嵌入(t-SNE)可視化，發(fā)現(xiàn)13個不同的細胞簇(圖1B, C)。5個簇(簇1，簇7，簇8，簇10和簇11)在不同的患者和正常供者之間是常見的，而其余的大多數(shù)簇是針對個別患者特異性的，顯示出高度的內(nèi)相關性(圖1A, C, D)。

由于clusters 2、3、4、5、6和13是患者特有的，在正常供體中看不到(圖1B、C)，假設這些是惡性細胞，因為患者特異性的惡性細胞聚集是典型的單細胞分析，可能是因為存在特定于單個腫瘤的遺傳/表觀遺傳改變。使用互補的方法來明確區(qū)分惡性和非惡性免疫細胞(t細胞、b細胞和單核細胞)(圖1F)。SNVs和CNVs與臨床測序結(jié)果一致，僅在假定的惡性細胞群中檢測到，值得注意的是，沒有檢測到等位基因頻率為40%的SNVs和低水平表達的基因中的SNVs，可能是由于退出事件。

二、ETP-ALL表現(xiàn)出錯亂的發(fā)育層次，譜系承諾無效，同時存在莖樣狀態(tài)

為了進一步探索單個細胞內(nèi)的譜系失真，尋找表達HSC(造血干細胞),MPP(多能祖),CMP(常見的髓系祖)、GMP (granulocyte-monocyte祖)和CLP(常見的淋巴祖)早期家族signatures,按照BLUEPRINT consortium,以及胸腺前體signatures(ETP, DN1, DN2、DN3 DN4和DP), ImmGen定義的研究。大多數(shù)白血病細胞表現(xiàn)出高表達的DN1 signatures，與他們的臨床注釋ETP-ALL一致.

盡管干細胞和譜系標記物在幾乎所有被研究的細胞中都有共表達，但仍可能有一種細胞亞群具有更強的干細胞樣特征。為此，我們首先使用t-SNE根據(jù)與造血干細胞和祖細胞程序相關的基因表達對所有白血病細胞進行聚類。

然后，我們利用RNA速度，基于未剪接/剪接轉(zhuǎn)錄本的水平，沿著成熟軌跡識別細胞。t-SNE維度上的速度投影顯示了兩種不成熟的根狀態(tài)和一種單一的端點狀態(tài)(圖2C)。這些狀態(tài)分為不同的無監(jiān)督集群，由來自所有患者的細胞組成，表明它們是由獨立的轉(zhuǎn)錄回路控制的。

E.兩種root states 都富含與造血干細胞相關的基因，如CD34, CD44, NCAM1, BCL11A和GATA2. 相反，終點狀態(tài)的特征是與t細胞分化相關的基因的表達，如IL7R, LCK, BCL11B和CD387，通常在 stem-like root 細胞中低水平表達.終點細胞也表現(xiàn)出強烈的免疫調(diào)節(jié)信號富集，表現(xiàn)為IRF1、IFITM3和IFI44L的表達.

細胞周期分析表明，root 1細胞不循環(huán)，而root 2細胞富集于S期細胞(圖2F, S14)。如果這些根狀態(tài)反映了不同的類莖狀態(tài)，那么應該有不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子驅(qū)動著每個狀態(tài)。因此，我們利用SCENIC24識別出這兩種根狀態(tài)中最顯著的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因)

所有這些ETP-ALL模型也顯示了在同一細胞中多個前體信號和更成熟的胸腺細胞信號的共表達，不依賴于Notch突變狀態(tài)(圖2H).

雖然成熟T-ALL細胞也同時表現(xiàn)出HSC和CLP signatures，同時表現(xiàn)出更成熟的胸腺signatures，但髓系程序(GMP, CMP)的激活比ETP-ALL PDX模型中少見(圖2I)。

三、干細胞樣狀態(tài)的特征是通過Notch或PI3K來反對致癌信號

假設莖狀種群的持久性存在可能是Notch抑制劑對復發(fā)/難治性切口突變T-ALL患者療效有限的原因。事實上，Notch抑制消除了循環(huán)的莖樣根細胞(root 2)，而非循環(huán)的根細胞(root 1)在Notch抑制劑處理后仍然存在(圖3A)。

該分析表明，PI3K激活是Notch信號通路中最抗相關的通路，PI3K激活在非循環(huán)根細胞中強烈富集，而在循環(huán)根細胞中幾乎不存在.

有趣的是，PI3K信號活性高而Notch信號活性低的細胞已經(jīng)在預處理前出現(xiàn)(圖3C)， PI3K活性隨著處理的增加而增加，而Notch活性則下降(圖3D, E, F, S14;表S14).

G.進一步分析這些亞群的轉(zhuǎn)錄動力學發(fā)現(xiàn)，在未經(jīng)處理的細胞中有兩種狀態(tài)，具有較高的Notch活性或較高的PI3K活性，通過RNA速度，拮抗分化軌跡均指向與中間PI3K和Notch活性共享的狀態(tài)(圖3G)。

H-I. 莖樣根細胞分為Notchactive和PI3K活性群(圖3H，相關系數(shù)R = -0.7, p = 2.2e-16)，而端點態(tài)細胞在界面處富集，而Notch與PI3K活性無相關性(圖3I, R = -0.28, p = 1.2e-07)。

J. 在治療過程中，PI3K活性較高的亞簇占優(yōu)勢，但它們向界面中間端點狀態(tài)的分化軌跡沒有任何變化(圖3J)。

到目前為止，分析主要集中在具有NOTCH1突變的復發(fā)/難治性ETP-ALL患者，接下來，我們研究是否可以在PDX模型中檢測到分化的Notch和PI3K狀態(tài)，該模型是在治療前的診斷時獲得的樣本建立的。

A.在7個ETP-ALL PDXs和5個成熟T-ALL PDXs中(見表2)，具有高Notch表達特征的細胞PI3K激活特征較低，反之亦然。

B-C.在兩種根狀態(tài)下，我們發(fā)現(xiàn)Notch信號和PI3K信號的激活信號存在差異，低循環(huán)狀態(tài)的根細胞表達高PI3K激活信號，高循環(huán)狀態(tài)的根細胞表達更高的Notch激活信號。這些發(fā)現(xiàn)獨立于NOTCH1突變或PTEN缺失的存在，這與作為這些細胞狀態(tài)基礎的轉(zhuǎn)錄重組是一致的.

D. 結(jié)合靶向Notch和PI3K信號通路可能同時靶向干細胞樣狀態(tài)。為了驗證這一假設，我們首先在體外證實了Notch抑制(GSI)和PI3K抑制(Buparlisib)聯(lián)合在T-ALL細胞系中的協(xié)同效應(圖4D, S19A-C)。

E. 我們推斷這一群體可能反映了先前存在的PI3K依賴性細胞。使用單細胞克隆，我們確認了已經(jīng)存在的gsi耐受細胞群體(圖4E)。這些細胞高度依賴PI3K信號通路，在GSI存在下單細胞克隆之前，通過Buparlisib預處理幾乎完全消除了這些細胞(圖4E).

F.在未處理的KOPT-K1細胞中檢測到一小群CD34+細胞(圖4F, S19D)，約20%的細胞通過磷酸化流分析顯示PI3K激活，而CD34- KOPT-K1細胞這些標記物呈陰性。此外，當GSI處理KOPT-K1細胞時，該群體擴大，而PI3K抑制具有相反的作用(圖4F). 

四、白血病微環(huán)境中Galectin-9的HAVCR2相互作用導致的免疫逃避

ETP-ALL是否與免疫微環(huán)境中t細胞功能的改變有關。值得注意的是，與正常供體t細胞相比，白血病患者中內(nèi)源性t細胞的t細胞受體(TCR)庫偏向于使用 oligoclonal TCR(圖5A)。

D.為了確定CD8+ t細胞分化狀態(tài)，我們使用monocle 2進行了非監(jiān)督偽時間分析，并確定了六種t細胞狀態(tài)沿著共同的軌跡發(fā)展(圖5B)。狀態(tài)1主要由來自正常供者的CD8+ t細胞組成，這些細胞表達幼稚CD8+ t細胞的標志物(CCR7, IL7R, NELL2, SELL, TCF7)(圖5C, D).

相比之下，狀態(tài)5和狀態(tài)6主要包含患者CD8+ t細胞，CD8+ t細胞表現(xiàn)出t細胞耗竭標志物(PDCD1、TIGIT、LAG3、HAVCR2、CD244)的表達增加，提示這些細胞存在功能障礙(圖5D)。RNA速度分析證實了從狀態(tài)5向功能更失調(diào)狀態(tài)6的分化方向(圖5E)。

為了確定衰竭的程度，我們分析了所有CD8+ t細胞的衰竭評分。高衰竭評分主要出現(xiàn)在ETP-ALL患者使用寡克隆TCR的細胞中，而高衰竭評分的CD8+ t細胞在正常供者中則不常見(圖5F)。

B.為了確定哪些配體和受體可能與ETP-ALL中的t細胞功能障礙相關，我們測定了它們的表達水平，并計算了白血病細胞中CD8+ t細胞表達的抑制性受體及其各自配體之間的相互作用scores70(圖6A, B)。發(fā)現(xiàn)HAVCR2 (TIM-3)及其配體LGALS9 (Galectin-9)的相互作用得分最強，LGALS9在所有白血病細胞中普遍表達(圖6B, S20A)。

C.ETP-ALL患者骨髓活檢免疫組化(IHC)染色證實白血病原細胞上LGALS9表達，散在單核細胞上HAVCR2表達(圖6C)。

D. 為了檢驗T-ALL細胞是否會引起t細胞功能障礙，我們首先通過流式細胞術證實了LGALS9蛋白在T-ALL細胞系中的表達(圖6D, S21).

E. 然后，我們將來自正常供者的活化的CD8+ t細胞(含和不含T-ALL上清液(含LGALS9))培養(yǎng)三天。暴露于T-ALL上清液的CD8+ t細胞顯示出主要的CD8+ t細胞效應分子GZMB (granzyme B)的下調(diào)，衰竭標志物HAVCR2和TIGIT的上調(diào)(圖6E)，而這一作用被一種中和性抗lgals9抗體所消除(圖S22)。

【總結(jié)】

該研究明確了可表征T-ALL的信號程序、細胞可塑性和免疫程序之間復雜的相互作用，并闡明了腫瘤異質(zhì)性的多維性。在這種情況下，針對不同致癌狀態(tài)和免疫生態(tài)系統(tǒng)的聯(lián)合治療似乎最有希望通過共存的轉(zhuǎn)錄程序成功消除免疫逃逸的腫瘤細胞。