據統計，包括肝細胞癌（HCC）在內的原發性肝癌（占病例的80％）是全球癌癥相關死亡的第四大主要原因。肝臟與腸道關系密切，并執行與營養代謝、免疫力和細菌代謝產物的生物轉化有關的必要功能，這種交流稱為腸道-肝軸。完整的腸肝軸取決于完整的腸屏障、健康的腸道菌群和正常的肝功能。腸道菌群是與人體共生的最重要的微生態系統。此外，還發現了一些臨床特征（年齡、體重指數、飲食習慣和體育鍛煉）對健康中國人的腸道微生物組有不同的影響。肝疾病，如非酒精性脂肪肝病和肝硬化，通常與具有改變的腸道微生物群相關聯，并且腸道細菌產物有助于肝癌發生。先前的研究已經表明，腸道微生物是西北、中部和華東地區早期和晚期HCC的非侵入性生物標志物。然而，尚無關于大批HCC患者的腸道微生物特征是否可用于評估臨床預后的報道，以及腸道菌群如何影響HCC轉錄組譜尚不清楚。近期，浙江大學醫學院第一附屬醫院肝膽胰外科鄭樹森教授及其團隊獲得了華東地區患者肝轉錄組和腸道微生物組的配對數據，發現在具有高腫瘤負擔的HCC患者中，擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa富集，且這三個屬中與腫瘤免疫微環境或膽汁酸代謝相關的六個重要微生物標志物具有預測臨床結果的潛力，相關研究以“Integrated analysis of microbiome and host transcriptome reveals correlations between gut microbiota and clinical outcomes in HBV-related hepatocellular carcinoma”為題發表在Genome Med上，雜志影響因子10.675。

技術路線：

結果：

1.      臨床特征和微生物多樣性

113例HBV相關的HCC患者和100名健康志愿者，都是華東地區的漢族人群，他們具有類似的飲食習慣（混合飲食），以排除飲食差異。這些組的臨床病理特征通常匹配，包括年齡、性別、BMI、腫瘤分化和Child-Pugh評分，表明在收集樣本之前，尚無確定的混雜因素影響群體歧視（圖A）。肝癌患者的血清甲胎蛋白（AFP）水平明顯高于健康對照者，但AFP水平無法區分HCC患者的腫瘤大小或肝硬化。進行分類分配后，總共獲得了7934068個合格序列和1296個OUT。稀疏分析發現，健康對照組和HCC組OTU的估計豐富度幾乎達到飽和（圖B）。與對應物相比，在非小型HCC中，每個樣品中糞便微生物物種的多樣性顯著增加（圖C-E）。然而，健康志愿者和HCC患者之間無差異。維恩圖顯示，三組共有1002個OTU的總豐富度為541個（所有參與者中294個OTU的豐度均為零），而小HCC和非小HCC亞組共有877個OTU中的576個（圖F）。值得注意的是，1002個OTU中有75個是非小HCC組所特有的。對于β多樣性，通過Bray-Curtis距離評價的NMDS圖揭示了腸道菌群在所有成對樣本中的對稱分布（圖G）。

2.      微生物群落表達譜

三個主要細菌門是擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，總共占OTU的90%（圖A，B）。圖C和圖D顯示了屬水平上細菌群落（前10位）的平均組成。與健康對照組相比，HCC組中的擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa富集（圖E）。當進一步分析HCC組中分層的其他臨床特征時，擬桿菌、毛螺旋菌、梭菌XIV和副擬桿菌在非小HCC亞組中與小HCC亞組相比顯著富集（圖F，G）；為了發現高維生物標志物，應用LEfSe鑒定與不同臨床特征相關的主要細菌分類群。擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa在非小HCC亞組患者糞便中顯著過度表達，進一步對這3個屬的相對豐度進行聚類分析，結果表明這3個屬在非小HCC亞組中含量豐富（圖H）。桑基圖顯示了健康對照組和小HCC和非小HCC患者中分類群（門和屬）的主要比例。在高腫瘤負荷的參與者中，這三個菌屬的比例逐漸增加并成為主要菌屬，伴隨著其他細菌的變化（圖I）。

3.      肝臟腫瘤轉錄組概況

由于HCC患者證明了微生物群與臨床特征（腫瘤負荷）的顯著相關性，作者假設肝臟腫瘤發生轉錄組的變化可能與腸道菌群相關。113例患者中，根據測序的嚴格標準，最終收集32例HCC患者的配對腫瘤和癌旁非腫瘤肝組織。在這32例患者中，23例患有非小HCC。通過edgeR在32對腫瘤和癌旁非腫瘤肝組織中共鑒定出8101個差異表達基因（圖A）。基于初步的基因注釋和通路分析，29個差異表達基因被鑒定為與6個OTU（擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa的成員）呈負相關，形成31個OTU基因對。圖C和D顯示了兩個典型的OTU基因對（OTU_0134-CD6和OTU_0002-MAPK10）。在32例患者中，OTU_0134豐度的增加伴隨著HCC組織中CD6表達的降低，很明顯這種類型的下調在非小HCC患者中尤為明顯。小HCC通常意味著更好的臨床結果，基于GEPIA的Cox風險模型表明CD6和MAPK10是與良好臨床預后相關的腫瘤抑制因子。兩組之間蛋白水平的不同表達水平也顯示出與轉錄組學相同的結果（圖E，F）

作者對非小肝癌亞組與小肝癌亞組中差異表達的29個基因進行功能注釋，通路分析顯示，這29個基因聚集在免疫相關通路上（T細胞受體信號傳導、T細胞增殖的正調控、自然殺傷細胞活化和NOD樣受體信號傳導、對細菌來源分子的反應等），這些通路是腫瘤免疫微環境的組成部分（圖B，C）。為了闡明這些基因在腫瘤免疫微環境中的定位和作用，作者在HCC的獨立單細胞圖譜數據庫中發現22個基因在CD4+ T細胞中高表達，23個基因在CD8+ T細胞中高表達，23個基因在NK細胞中高表達，18個基因在巨噬細胞中高表達，17個基因在B細胞中高表達。根據GEPIA，這些基因也具有相互依賴的關系，表明腸道菌群可能通過一個共同因素影響HCC的轉錄組（圖D）。

4.      HCC腸道菌群和轉錄組之間的重要通訊介質

對于個體內相關性分析，作者重點關注臨床特征（如BMI、AST和甘油三酯的所有值或異常值）和腸道菌群（75個OTU與擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa匹配）之間的相關性。基于Pearson相關性的分析顯示4個膽汁酸相關OTU，而其他臨床特征未發現陽性和有意義的結果（圖A），且在32對肝組織樣本中鑒定出與這4種OTU相關的25個基因，這些基因影響肝臟膽汁酸代謝（細胞外和細胞內信號傳導、轉錄因子以及膽汁酸合成和外排）（B）。免疫組織化學證實，ATP結合盒亞家族C成員4（ABCC4）蛋白在高水平膽汁酸患者的腫瘤和癌旁非腫瘤肝組織中均高表達，提示膽汁酸可能是HCC腸道菌群與宿主轉錄組交流的重要介質（圖C）。

5.      臨床預后微生物標志物的鑒定

在113例患者中，高腫瘤負荷（非小HCC）和較高的膽汁酸水平表明臨床結局較差（圖A，B），通過評估以下OTU來評估腸道菌群預測臨床預后的能力：OTU_0002、OTU_0033和OTU_0134（與腫瘤免疫微環境和膽汁酸代謝均相關）、OTU_0794（與腫瘤免疫微環境相關）和OTU_0030（與膽汁酸代謝相關），并構建了隨機森林和支持向量機分類器模型，以預測113例患者的臨床預后（圖C）。這些OTU對于區分5年生存率具有良好的分類性能，數據表明這些與HCC腫瘤免疫微環境和膽汁酸代謝有關的OTU標志物有可能預測臨床預后。

結論：

1、擬桿菌、毛螺旋菌和梭菌XIVa在高腫瘤負荷的HCC患者中富集，血清膽汁酸可能是這3個屬與宿主轉錄組之間的重要通訊介質；在這3個屬中，與腫瘤免疫微環境或膽汁酸代謝相關的6個重要微生物標志物顯示出預測臨床結局的潛力。

2、總之，腸道菌群通過血清膽汁酸引起的腫瘤免疫微環境變化可能是與腫瘤負荷和不良臨床結局相關的重要因素。腸道微生物可以作為臨床特征和結果的生物標志物，宿主腫瘤的微生物相關轉錄本可以部分解釋腸道菌群如何促進HCC發病。

參考文獻：

Huang HC, Ren ZG, Gao XX, et al. Integrated analysis of microbiome and host transcriptome reveals correlations between gut microbiota and clinical outcomes in HBV-related hepatocellular carcinoma. Genome Med. 2020.