環狀RNA（circRNA）大量存在于大腦中，但絕大部分功能未知。為了尋找它們在帕金森疾病（PD）中的功能，作者對PD捐贈患者和對照供體大腦的不同腦區域組織進行RNA測序，篩選出與PD相關的circRNA和腦組織。本文于2020年9月發表在《EMBO Molecular Medicine》IF：8.821期刊上。

本文技術路線如下：

主要結果如下：

1、研究PD大腦circRNA的基因組資源

為了確定大范圍的基因表達和circRNA表達譜，特別是circRNA在PD個體特定腦區中是如何發生改變的，作者對PD患者和健康人的杏仁核（AMG），黑質（SN）和內側顳肌腦回（MTG）進行了測序。最初的非監督層次聚類的樣品異質性分析顯示MTG和ATG樣品的大量集群不能區分PD和對照患者（Figs 1A and B）。這可能反映了個體間的異質性。但SN腦區的基因表達可以區分PD和對照，這可能反映了由于SN中多巴胺能神經元缺失而導致的基因表達的更大差異（Figs 1C）。相一致的，酪氨酸羥化酶（TH）的水平在PD SN樣本中顯著下降，與PD時該腦區多巴胺能代謝的主要減少相匹配（Fig 1D）。

隨后作者對差異表達基因（DEG）進行了GO分析，結果顯示主要富集與細胞粘連，多巴胺生物合成過程等（Fig 1E）。隨后作者使用單細胞RNA測序數據確定表達這些DEG的細胞類型，發現這些DEG轉錄本主要表達在內皮細胞、少突膠質細胞和星形膠質細胞比神經元和小膠質細胞表達更高的比例（Fig 1F and G）。此外，SN神經元特異性DEG在PD中顯著減少，少突膠質細胞和小膠質細胞表達基因有增加的趨勢，可能反映了炎癥的升高。

為了尋找特異性DEG的共表達基因，進行了WGCNA分析，結果顯示基因被分成15個不同的模塊，并評估了模塊與性別，年齡，腦區等特征的關系。還鑒定了幾個模塊與特征的相關性，如Fig 1I所示，藍色模塊與腦區具有相關性，青色模塊與性別相關。通路分析和對組織相關模塊豐富GO項的搜索進一步發現了各種神經元和突觸功能項，并將疾病相關模塊與轉錄調節、RNA加工和線粒體聯系起來（Fig 1J）。這些結果可以確定PD大腦中circRNA水平的潛在變化。

Figure 1腦區域特異性mRNA表達譜顯示多細胞PD相關過程

2、SN表現出獨特的受PD影響的circRNA表達譜

外顯子環化反映了線性和反向剪接過程的選擇（Fig 2A）。為了鑒定PD中發生改變的circRNA，使用兩種不同的方式進行circRNA鑒定和定量。結果發現3407個只在PD大腦中表達的circRNA，1028個只表達于健康人的（Fig 2B）。重要的是，2755個circRNA存在于所有的腦區，但2914，3918，2483個circRNA分別只存在于AMG，SN，MTG中（Fig 2C）。無監督分層PCA聚類將SN circRNA和AMG，MTG的區分開來，和之前的DEG類似（Fig 2D）。此外，分別有26%的circRNA和mRNA特異性只存在于SN中，而只有19%的circRNA存在于所有組織，但有82%mRNA同時存在于所有組織（Fig 2E and F）。隨后，作者對表達這些差異circRNA的細胞進行分類，發現這些circRNA主要由神經元，少突細胞和星形膠質細胞表達（Fig 2G），表明在這些組織中circRNA多由這幾類細胞表達。

Figure 2 CircRNA豐度具有腦區依賴性和PD修飾性

在健康供體中，SN表達circRNA的總數目顯著高于MTG和AMG，這暗示著SN細胞擁有circRNA生物發生的特定調控模式（Fig 3A）；當與健康供體相比，可以發現circRNA的數目在PD患者的MTG和AMG顯著升高，而PD患者的SN中顯著減少（Fig 3A）。這些可能與PD患者的SN中的神經元細胞丟失相關并可能是繼發性的，以及/或該腦區域的剪接事件的改變。隨后計算了Alu編輯指數，它代表了所有RNA樣本中所有表達Alu序列的加權平均編輯水平。結果顯示，與其他大腦區域相比，SN的整體編輯水平較低（Fig 3B）。這些差異是RNA編輯活性的結果。還觀察到在個體樣本中，RNA編輯水平和circRNA的數量呈負相關（Figs 3D）。雖然從對照到PD樣本ADAR1水平沒有變化，但對不同組織分別進行探查發現，SN中ADAR1水平較其他組織低(Fig 3E)。因而認為RNA編輯和RNA環化在PD和對照組的腦的幾個區域中是負相關的。

接下來驗證circRNA積累與年齡的關系，結果在健康SN中發現circRNA積累與年齡正相關，但在PD患者的SN中 circRNA積累與年齡負相關（Fig 3F and 3G）。這些差異可能是由于circRNA在SN中的整體合成或降解速率的差異。但是circRNA積累和年齡的相關性在病變組織中并為觀察到，提示這種SN中circRNA積累和年齡的特異性相關反應了PD中多巴胺能神經元的大量丟失，盡管不能排除次生效應。差異表達分析鑒定到了24個差異表達的circRNA，并表明circSLC8A1在PD中顯著上調從而引起了作者的興趣（Fig 3H）。這些結果表明，相對于其他被測的大腦區域，circRNA在SN中受到獨特而強烈的調控，并提示了circRNA在PD中可能受到損害的潛在年齡相關作用。

Figure 3 circRNA豐度在PD SN中降低，與RNA編輯水平呈負相關

3、CircSLC8A1在PD腦中上調

CircSLC8A1，在PD SN中顯著上調，起源于神經表達的SLC8A1基因，它編碼一個Ca2+/Na+轉運體，有助于平衡細胞質Ca2+水平和監控Ca2+依賴的神經傳遞（Fig 4A and B）。不同于circSLC8A1在PD SN中顯著上調，線性的SLC8A1 mRNA在CT和PD之間沒有明顯差異（Fig 4C and 4D）。circSLC8A1的表達與性別無關，但在健康的SN中與線性mRNA的表達呈正相關，而在PD中這種相關性丟失了（Fig 4E-G）。這些表明疾病誘導的circSLC8A1下降的調控超過了circSLC8A1生產和/或破壞。

4、氧化應激使神經元的circSL8A1升高，并減少SLC8A1蛋白質

百草枯（PQ）已知會增加PD的風險，作者將神經細胞暴露于PQ中，結果發現PQ暴露選擇性誘導了circSL8A1的劑量依賴性升高，但對其余的circRNA的表達沒有顯著影響，暗示氧化本身可能會增加神經元中circSLC8A1的環化或減少circRNA的降解（Fig 4H）。還觀察到SLC8A1的蛋白水平呈劑量依賴性下降，盡管SLC8A1 mRNA水平不變（Fig 4I and J）。這可能反映了在24小時內該蛋白降解速率加快和/或轉譯速率降低。

Figure 4 PD腦中的CircSLC8A1升高，PQ暴露時伴有SLC8A1蛋白的抑制

考慮到PQ對circSLC8A1水平的強烈影響，作者想知道兩種已知的PD保護劑，降膽固醇藥辛伐他汀和已知的LRRK2抑制劑PF-06447475是否會以相反的方式改變circSLC8A1。事實上，兩種神經保護劑均能顯著降低circSLC8A1的表達，也觀察到線性SLC8A1 mRNA水平下降（Fig 5A），這導致他汀類藥物治療的SH-SY細胞中SLC8A1蛋白水平下降（Fig 5B and C）。免疫染色顯示，在他汀類藥物作用下，SLC8A1免疫標記蛋白的細胞質表達較低。結論是，在神經保護細胞中，SLC8A1和circSLC8A1水平都下降。

Figure 5在神經保護下，CircSLC8A1降低

5、CircSLC8A1與Ago2結合，可能調節miR-128的靶點

形成人的circSLC8A1轉錄本的外顯子是開放閱讀框的一部分。因此，這個外顯子在進化上保守：在人類、小鼠和大鼠的基因組中，這個外顯子分別有88%和87%的序列保守（Fig 6A）。通過qRTPCR對細胞進行亞分類，發現circSL8A1像大多數circRNAs一樣定位于細胞質（Fig 6B）。進一步發現人circSLC8A1在神經細胞中與Ago2相互作用(圖6C)，并具有特異性的連接位點（Fig 6D）。于是，作者預測了與circSLC8A1相互作用的miRNA，如Fig 6E。其中在circSLC8A1上發現了7個miR-128的潛在靶點，其中三個位點被鑒定為ago2結合位點（Fig 6E）。因此預估了circSLC8A1與miR-128的相互作用。如果兩者有調控關系，則miR-128的靶基因會隨著circSLC8A1的表達上調（Fig 6F）。結果表明，miR-128的所有靶基因都在PD的SN中顯著上調，而PQ處理的神經細胞系中，miR-128的靶基因上調趨勢和circSLC8A1的表達一致（Fig 6G and H）。表明circSLC8A可能調控miR-128靶點。

Figure 6在細胞質內circSLC8A1與Ago2結合并調控miR-128靶點

本文的發現建立了PD患者大腦中circRNA表達譜，揭示了之前未知的circRNA表達、氧化應激和PD病理之間的聯系，并呼吁探索circSLC8A1積累對PD神經退行性過程啟動的影響。

參考文獻：

Hanan Mor., Simchovitz Alon., Yayon Nadav., Vaknine Shani., Cohen-Fultheim Roni., Karmon Miriam., Madrer Nimrod., Rohrlich Talia Miriam., Maman Moria., Bennett Estelle R., Greenberg David S., Meshorer Eran., Levanon Erez Y., Soreq Hermona., Kadener Sebastian.(2020). A Parkinson's disease CircRNAs Resource reveals a link between circSLC8A1 and oxidative stress. EMBO Mol Med, 12(9), e11942. doi:10.15252/emmm.201911942