特發性肺纖維化(IPF)是一種進行性和不可逆的疾病。NRF2的藥理學激活已被證明是一種有價值的抗纖維化方法，然而NRF2如何介導抗纖維化功能的詳細機制仍不清楚。今天小編為大家帶來發表于影響因子為9.986的雜志“Redox Biology”的文章“The NRF2-LOC344887 signaling axis suppresses pulmonary fibrosis”，帶大家了解NRF2如何抗肺纖維化。我們的發現表明NRF2介導的LOC344887上調通過抑制CDH2和其他纖維化基因的表達有助于SFN的抗纖維化潛力，為NRF2如何控制特發性肺纖維化的調節網絡提供了新的見解。

技術路線：

結果：

1）LOC344887是NRF2靶基因

為了確定肺細胞中可能受NRF2調節的lncRNAs，進行了人轉錄組陣列分析。有趣的是，陣列分析表明，與野生型相比，NRF2敲除細胞中lncRNA (LOC344887)的表達顯著降低。野生型和突變型AREs的41-bp序列都被克隆到pGL4.22-熒光素酶載體中(圖1A)。免疫印跡分析表明SFN誘導了NRF2(圖1B)，并且在含有ARE1/2-WT的報告質粒轉染的細胞中，相對熒光素酶活性只在SFN的作用下增加(圖1C)。此外，NRF2-sMAF與ARE1和ARE2相結合結合 (圖1D和E)。通過CHIP-qPCR進一步證實NRF2與LOC344887的ARE1和ARE2的內源性結合(圖1F)。此外，與NRF 2+/+細胞相比，LOC344887的轉錄水平在NRF 2/-細胞中低得多(圖1G)，并且在H1299和HFL1野生型細胞系中均被SFN顯著增強(圖1H)。重要的是，在NRF2缺失后或SFN處理后，LOC344887的表達模式與NQO1相似(圖1G和H)。總的來說，這些結果表明LOC344887為肺細胞中的NRF2靶基因。

2）LOC344887敲除增強纖維化基因的表達

使用CRISPR/Cas9技術建立LOC344887敲除(KO) A549細胞系(圖2A)。兩對引物，一對定位于pac基因插入位點的上游(引物1)，另一對定位于下游(引物2)(圖2A)用于qRT-PCR分析。已證實插入位點下游的LOC344887轉錄在LOC344887-KO細胞中沒有發生(圖2B)。進行RNA-seq分析來比較LOC344887-WT和LOC344887-KO細胞中全基因組的基因表達變化。結果顯示，與LOC344887-WT細胞系相比，LOC344887-KO中733個基因上調，316個基因下調(圖2C)。GO和KEGG分析表明，LOC344887的缺失導致許多參與纖維化過程的基因過表達，包括ECM重組和產生、ECM-受體相互作用和肌動蛋白細胞骨架的失調(圖2D和E)。KEGG通路圖顯示PI3K-AKT信號通路可能與增強的纖維化過程有關(圖2E)。在LOC344887敲除細胞中顯著增加的轉錄物的熱圖顯示了許多參與纖維化過程的基因的增強表達，例如ACTA2(編碼α平滑肌肌動蛋白，α-SMA)、COL1A1(編碼I型膠原的主要成分)和FN1(編碼纖連蛋白)等(圖2F)。

3）SFN的抗纖維化功能在很大程度上取決于LOC344887

為了證實LOC344887在控制肺纖維化中的作用，LOC344887-siRNA被用于敲除HFL1細胞中的LOC344887轉錄物。與圖2所示的RNA-seq數據一致，LOC344887敲除在基因和蛋白質水平上增強了ACTA2/ α-SMA、COL1A1和FN1的表達(圖3A–C)。接下來，評估LOC344887對先前報道的SFN抗肺纖維化治療效果的貢獻。為了在體外模擬纖維化，使用了纖維化活化劑TGF-β。在基礎和TGF-β刺激條件下，SFN誘導NRF2表達并抑制ACTA2/ α-SMA、COL1A1和FN1的表達。然而，LOC344887敲除顯著限制了SFN對基礎和TGF- β刺激條件下這些蛋白表達減少的影響(圖3D和E)。值得一提的是，雖然SFN對這些纖維化基因表達的影響在LOC344887敲除組中比對照組弱得多，但SFN對NQO1的誘導不受LOC344887敲除的影響(圖3D和E)。

4）LOC344887基因敲除增加CDH2/N- cadherin的表達

另一個通過敲除LOC344887而上調表達的基因是CDH2，一種編碼跨膜細胞粘附蛋白N-鈣粘蛋白(N-Cad)的基因(圖4A)。SiRNA介導的HFL1細胞中LOC344887的敲除證實了CDH2的轉錄上調(圖4B)。當LOC344887被敲除時，N- Cad的蛋白質水平也得到提高(圖4C和D)。由于據報道N-Cad與EMT有關，會導致肺纖維化，因此檢測了N-Cad在纖維化基因表達中的重要性。CDH2的敲除導致ACTA2/α-SMA、COL1A1和FN1的表達降低(圖4E和F)。更重要的是，LOC344887對這些基因表達的影響可以通過敲除CDH2來消除(圖4G和H)。綜上所述，LOC344887可能通過改變CDH2基因表達來調節ACTA2/α-SMA、COL1A1和FN1的表達。

5）LOC344887通過PI3K- AKT信號通路調節CDH2/N-cad的表達

KEGG分析表明，受LOC344887敲除影響最大的途徑是PI3K-AKT信號途徑(圖2E)。事實上，在A549細胞中(圖5A和B)和在HFL1細胞中敲除LOC344887 (圖5C和D)增加了磷酸-AKT (Ser473)的水平，而不改變AKT的總水平。為了進一步證實PI3K-AKT信號通路在介導LOC344887缺失抗纖維化作用中的必要性，使用了PI3K抑制劑。LY294002不僅降低了磷酸-AKT、N- Cad、FN1、COL1A1和ACTA2/α-SMA的水平，而且完全消除了LOC344887增加這些蛋白的作用(圖5E和F)。因此，PI3K-AKT信號似乎在介導LOC344887對CDH2、FN1、COL1A1和ACTA2/α-SMA表達的影響中起關鍵作用。

結論：我們的研究闡明了NRF2-LOC344887在抑制纖維化中的獨特功能，并為治療人類肺纖維化或其他纖維化疾病開辟了新的治療途徑。

參考文獻：Liu, P., Luo, G., Dodson, M.,et al (2021). The NRF2-LOC344887 signaling axis suppresses pulmonary fibrosis. Redox Biology, 38, 101766. doi:10.1016/j.redox.2020.101766